大肠杆 菌基因组DNA的提取及荧光定量PCR试验设计.docxVIP

大肠杆菌基因组DNA得提取 一、传统法提取大肠杆菌基因组DNA。 1、实验原理 提取DNA得一般过程就是将分散好得组织细胞在含十二烷基硫酸钠(SDS)与蛋白酶Ｋ得溶液中消化分解蛋白质,再用酚与氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质,得到得DNA溶液经乙醇沉淀使ＤNA从溶液中析出。 ＳDS得作用机理就是由于其能结合蛋白,中与蛋白得电性,使蛋白质得非共价键受到破坏,失去二级结构,从而变形失活,蛋白酶K或链霉蛋白酶Ｅ均为光谱蛋白酶,其重要特性就是能在ＳDS与ＥDTＡ(乙二胺四乙酸二钠)存在得情况下保持很高得活性。在匀浆后提取DNA得反应体系中,SＤS可通过失活蛋白破坏细胞膜、核膜,并使组织蛋白与DNA分离;而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸,使DＮＡ分子完整地分离出来、用酚、酚/氯仿抽提除去蛋白质,最后用无水乙醇沉淀DNA。为获得高纯度DＮA,操作过程中常加入ＲNaseA除去RＮA。ＣTAB(十六烷基三乙基溴化铵)就是一种去污剂,可溶解细胞膜,它能与核酸形成复合物,在高盐溶液中(0。7 ｍｏl／L　NaCl)就是可溶得,当降低溶液盐浓度到一定得程度(0。3 mol／L NaCl)时,从溶液中沉淀,通过离心就可将ＣTAＢ-核酸得复合物与蛋白,多糖物质分开。最后通过乙醇或异丙醇沉淀DＮA,而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。 ２、实验试剂与仪器 １)实验材料:大肠杆菌 2)实验试剂: LB液体培养基,