基因克隆实验讲义2010最终版.docx

PAGE PAGE # 基因克隆实验讲义 黑龙江大学生命科学学院 2010年9月 目的基因的克隆与鉴定 、实验目的 1、 熟悉和了解目的基因克隆与鉴定的过程和方法。 2、 学习和掌握质粒、T载体的特点。 3、 学习和掌握TA克隆的连接体系及操作要点。 4、 学习和掌握Xcm I酶切制备T载体的过程及方法。 5、 学习和掌握CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的原理和方法。 6学习并掌握热激法转化技术的原理和操作步骤。 7、学习并掌握重组子鉴定和筛选的原理及蓝白筛选的原理和方法。 8、学习并掌握碱法小量制备质粒 DNA的原理及操作步骤。 二、相关知识 （一） T载体的制备 PMD18-T Vector是一种高效克隆PCR产物（T-A Cloning）的商业化专用载 体，由pMC 18载体改建而成。在pMC 18多克隆位点处的Xba I和Sal I识别 位点之间插入了 EcoR V识别位点，用EcoR V进行酶切反应后，再左两侧的 3 端添加“T”而成，可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。 相关知识点：（1）质粒的提取；（2）酶切；（3）PCR等。 （二） DNA的重组与连接（PCR产物的克隆） 把DNA片段从某一类型的载体无性繁殖到另一类型载体中，例如从某种 质粒克隆到另一种质粒，这个过程称为亚克隆。所谓重组，就是把外源目的基 因装进”载体的过程，即DNA的重新组合。为了将目的基因重组于载体分子 中，需要将载体DNA和目的基因分别进行适当处理，一般采用内切酶法将载 体DNA分子切割成可与外源基因连接的线性分子，使其与相同酶切过的载体 分子相互连接，彼此成为配伍末端（compatible end），以产生末端连接。现在 一些生物公司也开发了针对不同插入 DNA片段的专用载体，如专门用于克隆 PCR产物的载体，大大方便了实验操作。 相关知识点：（1）克隆与亚克隆；（2） DNA重组；（3）内切酶；（4）粘性 末端与平末端；（5）连接酶；（6）连接酶的分类及功能等。 （三）大肠杆菌感受态细胞的制备 外源基因与载体在体外连接成重组体 DNA分子后，需将其导入受体细胞 进行扩增和筛选，得到大量、单一的重组体分子，这就是外源基因的无性繁殖， 或称为克隆。受体细胞也叫宿主细胞，大肠杆菌宿主菌是目前基因工程最常用 的受体细胞。感受态细胞（competent cell）是经过一定方法处理后，具有接受 外源DNA能力的大肠杆菌，只有发展了感受态的细胞才能稳定地摄取外来的 DNA分子。 相关知识点：（1）克隆；（2）宿主细胞的定义及分类；（3）感受态细胞定 义及其功能；（4）转化定义及方法（DMSO、MnCI2、TB aq、PEG）等。 （四）重组DNA的转化及重组子的鉴定 将外源DNA分子导入某一宿主细胞的过程称为转化。 把重组DNA分子导 入到细菌中产生克隆有两个目的，一是大量产生重组 DNA分子，在完成连接 反应后，重组DNA分子往往只有纳克级的量，不易操作和进行下一步的分析， 若把重组DNA分子导入到细菌细胞中，细菌细胞可分裂多次产生克隆，克隆 中每一个细胞都含有很多个拷贝的重组 DNA分子，这样重组DNA分子的量就 多了；二是对重组DNA分子进行纯化，在构建重组DNA分子的过程中很难保 证体系中不污染其他的DNA分子，连接过程完成以后体系中有多种分子存在， 除了需要的重组DNA分子以外，还含有没有连接上的载体分子、没有连接上 的DNA片段、自身环化的DNA分子和连接上污染DNA片段的重组DNA分 子，未连接上的载体和 DNA片段对实验影响不大，因为它们即使导入细菌细 胞，因为不能复制，很快就要被细菌细胞中的酶降解掉；对克隆工作带来影响 的是后两种分子，因为它们都为环状，在细菌细胞中都能复制，因而都能产生 克隆，但是每个细胞中只能导入一个质粒 DNA分子，每个单克隆都是由一个 细胞形成的，因此在每个克隆中所有的细胞都只含有同一种质粒。所以只要对 不同的克隆进行筛选，就可以鉴定所需的重组 DNA分子。 所谓的重组子（recombinant）也叫做转化子（transformant）是指吸收了重 组DNA分子的转化细胞。将重组子从其它细胞群中（如上面提到的对克隆影 响较大的自身环化的DNA分子和连接上污染DNA片段)分离出来，并鉴定无 性繁殖的外源基因确实为目的基因，这过程称为筛选(screening)。根据载体体 系、宿主细胞的特性以及外源基因在受体细胞表达情况的不同，初步把筛选方 法分为直接筛选和间接筛选，直接筛选法又可进一步分为 DNA鉴定筛选法、 选择性载体筛选法、分子杂交选择法；间接筛选也可以进一步分为免疫学方法、 mRNA翻译检测法；本试验采用平板筛选法中的蓝白筛选法。 相关知识点: (1)导入的方法(2)(3)(4)『①