拟南芥植物组织培养.doc

拟南芥组织培养 一、 种子消毒： 方法一：将拟南芥种子置于1?5 ml eppendorf管（微量离心管）中，加入1 ml蒸馆? 水，4C春化3 d, 70 % （v / v ）乙醇lmi n> 7 % （v / v ）次氯酸钠10 mi n浸泡消毒， 并用无菌水冲洗5次。 方法二：在超净工作台内，用无菌蒸镭水浸泡1 min,然后用80%乙醇消毒90s,最后用 无菌蒸镭水冲洗3?5次备用。 消毒完毕的种子可以用200山的tips吸去洗涤液，然后在超净工作台丄挥发掉残余水分、洗 涤液。 方法三、取野生型拟南芥种子放人离心管内，75%乙醇清洗后，无菌蒸锚水清洗1—2次, 转入无菌离心管；5%次氯酸钠溶液浸泡5—6 min,用无菌蒸惚水清洗3?4次，加入1 ml 无菌水，用移液枪接种。 二、 选用的培养基 选用1/2MS培养基对种子进行培养。（MS和1/2MS都可以，1/2MS就是大量元素减 半，其他东西和ms培养基是一样的量。糖可以加，会长得比较好，但是也很容易污染。 如果在平板丄要牛长吋间比较长，需要做一些实验的，比如根的发育，最好不要加。）也 可以用MS+30 g / L蔗糖的固体培养基。（我想两种培养基都接种丄，比作对比确定好 坏）。 MS培养基配料表： 三：接种方法 拟南芥种子消毒后，用移液枪吸取拟南芥种子和水的混合物，均匀地在MS生长培 养基的培养皿平板上滴落，并使之形成两条平行的直线。（如不行，可适当添加琼脂）。 四、 培养得无菌苗 接种后置于光照培养箱（型号：GX乙500C；培养光照条件为16小吋光照，8小吋黑 暗，培养温度为22°C屮竖直培养。3天后即可取材用于器官离体再生实验。萌发5天后， 在超净工作台屮，用锡子将苗移栽到装有1 /2 MS培养基的50ml三角瓶屮（每瓶4??6棵, 视情况而定），于短日照条件下培养30天左右获得无菌苗。（短日照光照条件8小时光照， 16小时黑暗,长日照光照条件为16小时光照,8小时黑暗,培养温度均为22°C。）此处获 得无菌苗的时间有男议，应该为2-3周？ 五、 外植体的选取 B5 + 5 mg / L2 , 4-D+0 .5 mg / L KT培养基丄诱导愈伤组织,莲座叶作外植体出愈 慢，出愈率低，愈伤组织质量较差；叶柄、下胚轴和根作外植体出愈快，且愈伤组织质 量好，后期易分化。 由于叶柄、下胚轴相对较短，难于收集，为了便于操作，减少污染，试验中采用根 作为外植体诱导愈伤组织和诱导分化试验。 所取外植体的大小为5mm左右，不宜过大或过小。 滴落种子形成的两条直线位于平血的上半部，可以避免伸长的根被培养基屮渗出的 水分所淹。无菌苗的苗龄太短不易得到足够多的外植体，苗龄太长则外植体脱分化的时 间明显延长，最适苗龄以2-3周为宜。 六、 胚性和非胚性愈伤组织的诱导 1、 以MS为诱导培养基，附加2,4 -D 2mg/L,KT> NAA各0.5mg/L,水解酪蛋白 300mg/L, 6%蔗糖，0.7琼脂，PH5.8 2、 接种幼穗长度为l-2cm左右，置于2 8 °C恒温箱内喑培养。 形态鉴定：幼穗接种后，一屋期左右开始长出愈伤组织。将其置于解剖镜下观察可以发现两种不同类型的愈伤组织。一类质地紧密，有光泽，乳白色或浅黃色，愈伤组织表面有 许多光滑的球形突起，呈颗粒状。每个球状体用银子很易从愈伤组织上分离下来。这种愈 伤组织被认为是胚性愈伤组织。另一类质地疏松且湿软，常伴有粘液物质，没有光泽，黄 色至褐色，此类愈伤组织没有一定的形态结构。(栽培稻) NB培养基可明显提高拟南芥的愈伤组织出愈率，且以NB培养基为基础配以2, 4 —D 2. 0 mg / L^6-BA 1. Omg/L时，拟南芥的愈伤组织生长状态最好。 MS+ 2, 4 DO. 5 mg/L+6 BA 0. 3 mg/ L,诱导率达87. 5%,且愈伤组织生长较好。培 养基屮添加5 g/ L活性炭能有效地抑制外植体褐化。 MS培养基对釉稻种胚愈伤的诱导培养效果较好,NB培养基则更适合粳稻种胚愈伤的 诱导培养。诱导继代培养基为NB( N6培养基的大量兀素,B5培养基的微量兀素和有机物)、 MS和LS基本培养基，辅加2, 4- D( 2.5mg /L ), 6- BA( 0.5mg /L), 30 g /L蔗糖,10 g / L琼脂 或3g/L植物胶。 BA对于愈伤组织诱导不可缺少，但其浓度太高易产生玻璃化；NAA单独使用利于生 根，配合6-BA使用利于分化芽；获得最适愈伤组织诱导培养基为Ms+O. 50 mg/L 6-BA+O?10me,/LNAA,愈伤组织诱导率可达100%。 NB培养基 配方：(mg/L) 硝酸钾(KNO3) 硫酸钱((NH4)2SO4) 氯化钙(CaC12-2H2O) 磷酸二氢钾(KH2PO4) 硫酸镁