6基因与载体连接.ppt

第六章 基因与载体连接 一、黏性末端与平末端的连接 二、其他连接方法 一、黏性末端与平末端的连接 一）黏性末端 DNA 分子间的连接 DNA 连接酶把相 互靠近的 5 端磷 酸与 3 -OH 连到 一起。 1. 两段 DNA 的连接 依 靠 粘 性 末 端 依靠粘性末端 2. DNA 片断 与载体的连 接 nick ligase 3. 4 . 粘性末端的更换 在 DNA 片段上某一酶切口处换成另一种酶切口 二 ) 平末端（ blunt end ）的连接 5 端与 3 端并列靠近的时间太短，不容易 被连接酶连接。 1. 直接连接 T4DNA 连接酶虽然能连接平末端，但 效率很低，只有粘性末端的 1% 。 5 5 5 5 3 3 3 3 -OH -OH -P -P P- P- HO- HO- 5 3 -OH -P P- HO- 5 3 1972 年，斯坦福大学的 P. Labban 和 P. Kaiser 提出。 （ 1 ）同聚物加尾 法 2. 人工加尾形成 “ 粘性末端 ” DNA 末端转移酶 能在没有模板的情况下 给 DNA 的 3 -OH 端 加上脱氧核苷酸。 ①原理： 分别给载体和插入片断加上 互补的 核苷酸。 ②加尾—碱基互补 ④缺点： ③优点： 能把任何 片段连接 起来 不能把 插入片 段再切 下来。 非酶切位点 5‘ 突出的末端 外源片段先用 Klenow 补平；然后用 TdT 补加 polyC ； 载体片段也用 Klenow 补平，加 polyG ，退火不经连接即 可转化。目的是：不使酶切位点遭受破坏。 5 ‘ 3 ‘ 3‘ 5 ‘ 5 ‘ 3 ‘ 3 ‘ 5 ‘ 外源基因 载体 TdT ployC TdT ployG Klenow 补 3‘ 平端 5 ‘ 5 ‘ 5 ‘ 5 ‘ CCCCC CCCCC GGGGG GGGGG 退火 用 T4 DNA 连接酶连到平端 DNA 上，然 后再用酶切，形成一个人工粘性末端。 （ 2 ）衔接物 (linker) 连接 ① linker 用化学合成法合成的一段 10-12bp 的特定限 制性内切酶识别位点序列的 平端双链 。 G GAATTC C C CTTAAG G EcoRI linker ： ② linker 的作用 ④缺点： 1 ）可以用内切酶把插入片段切下来。 如果插入片段内部也有该酶位点，不能 切下完整的插入片段 2 ）能给载体连接上 Polylinker: ③优点： （ 3 ） DNA 接头 (adapter) 连接法 1978 年康内尔大学的吴瑞教授发明。 5‘p - GATCC CGG- OH3 G GCC- p 5 B am H I adapter 用 T4 DNA 连接酶连到 DNA 分子的 两端，直接成为人工粘性末端。 ① adapter 一头平末端、另一头粘性末端（某种酶 切位点序列）。 ② adapter 的作用 Blunt-ended DNA 5p - GATC CCGG- OH3 HO-GGCC- p5 B am H I adapter P- -P 5‘p - GATC CCGG- GGCC- -CCGG -GGCC CTAG - P5 5‘p - GATC CCGG- GGCC- CCGG GGCC CTAG - P5 CCGG GATC CCGG-OH GGCC CTAG GGCC- P5 接头自我连接 接头与接头会彼此以粘性末端接在一起， 影响与 DNA 片段的连接。 ③优点： 连上后就能用。 ④缺点： 先用小牛肠 碱性磷酸酶 （ CIP ）处理接头， 水解掉其 5 端的磷酸，防止自我连接。 （以后再用 T4 多核苷酸激酶 加上磷酸。） ⑤防止自我连接 5‘p - GATC CCGG-OH HO-GGCC-P P-CCGG-OH HO-GGCC CTAG - P5