植物新基因克隆的策略与方法课件.ppt

? 技术流程 (1) 提取两种细胞的 mRNA, 反转 录后成为 2 种 cDNA ； (2) 以随即引物和猫定引物作随 机聚合酶链反应； (3) 通过扩增产物的电泳分析 , 分 离出不同样品间的差异条带； (4) 将差异 DNA 做成探针，或设 计特异引物； (5) 在 cDNA 文库或基因组文库 中筛选基因并作功能分析，或进 行 RT-PCR 和 RACE 扩增基因。 31 ? 技术特点 ①简单，技术上仅仅依靠 PCR 和 DNA 测序胶电泳； ②可以同时分析多组样品； ③灵敏性高，仅需 0.2 μg 总 RNA 作为起始材料， 可检出低丰度 mRNA ； ④实验周期短，约 8 d 即 可完成，便于重复； ⑤最突出的优点是实验过 （ 1 ）假阳性率高，假阳性的 比例有时高达 50 ％～ 75 ％。 （ 2 ）由于某些序列的特异性， 一些差异表达的转录不能得到 分离，所以凝胶中的单条带可 能由 1 种以上 cDNA 片段所构 成。 （ 3 ）差异显示所得的 cDNA 片段较短，长度多在 100 bp ～ 400 bp 之 间 ， 且 大 多 位 于 mRNA 3 ′ 端约 300 bp 的非翻译 区 （ untranslated regions,3 ′ UTR ）。 32 ? cDNA-AF