荧光分光光度法测定药液维生素b2含量总论.ppt

荧光分光光度法测定药液维生素 B 2 的含量 实验目的 ? 学习荧光分光光度法测定药液中维生 素 B 2 的分析原理。 ? 掌握荧光分光光度计的操作技术和测 定药液中维生素 B 2 的方法。 实验原理 荧光分析法 常温下，处于基态的分子吸收一定的紫外可见光的辐射能成为激发态 分子，激发态分子通过无辐射跃迁至第一激发态的最低振动能级，再以 辐射跃迁的形式回到基态，发出比吸收光波长长的光而产生荧光。 在稀溶液中，荧光强度 I F 与物质的浓度 c 有以下的关系： 当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系： 这是荧光光谱法定量分析的理论依据。 bc I I F ? ? 0 303 . 2 ? Kc I F ? a. 与紫外 - 可见分光度法比较，荧光分析法具有更 高的灵敏度。 b. 选择性好。荧光法既能依据发射光谱，又能依 据吸收光谱来鉴定物质。 c. 所需试样量少、操作方法简便。 荧光分析法的特点 激发光谱：固定测量波长 ( 选最大发射波长 ) ，化合物发射的荧光强度与 照射光波长的关系曲线。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多， 荧光强度最大。 发射光谱：固定激发光波长 ( 选最大激发波长 ), 化合物发射的荧光强度与 发射光波长关系曲线。 固定发射光波长进行激发光波长扫描，找出最大激发光波长，然后固定 激发光波长进行荧光发射波长扫描，找出最大荧光发射波长。激发光波长 和发射荧光波长的选择是本实验的关键。 荧光光谱 激发光谱 发射光谱 荧光分析仪器 常用的荧光分析仪器由激发光源、单色器、液槽、检测器和显示记 录器五部分构成，如下图所示： 荧光分析仪器与分光光度计比较主要差别有两点： a. 荧光分析仪器采用垂直测量方式，以消除透射光的影响； b. 荧光分析仪器有两个单色器，能够获得单色性较好的激发光并消除其 它杂散光干扰。 液槽 显示器 单色器 检测器 I 0 I I f 光源 单色器 a. 光源：在荧光计中常用卤钨灯作光源；荧光分度 计常采用高压汞灯或氙弧灯做光源。 b. 单色器：荧光计的单色器是滤光片，只能用于定 量分析；荧光分光光度计采用两个光栅单色器，可 获得激发光谱和荧光光谱。 c. 检测器：荧光计采用光电管作检测器；荧光分光 光度计采用光电倍增管作检测器。 仪器部件 维生素 B 2 （又叫核黄素， VB 2 ）是橘黄色无臭的针状结 晶，其结构式为： 维生素 B 2 易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸 性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定。 药液维生素 B 2 含量的测定 维生素 B 2 溶液在 430 ～ 440 nm 蓝光的照射下，发出绿色 荧光，其峰值波长为 525 nm 。 VB 2 的荧光在 pH=6 ～ 7 时最强， 在 pH=11 时消失。维生素 B 2 在碱性溶液中经光线照射会发生 分解而转化为光黄素，光黄素的荧光比核黄素的荧光强的多， 故测 VB 2 的荧光时溶液要控制在酸性范围内，且在避光条件 下进行。 H 3 C H 3 C N N R N NH O O [O] C C C H C C H C H 3 C H 3 C CH C H CH 3 C C C H C CH 2 CH 2 C CH 2 光黄素 实验预习 ? 预习荧光分光光度法测定维生素 B 2 的分析原 理。 ? 了解荧光光度计的操作步骤和测定维生素 B 2 的方法。 F96 型荧光光度计（上海棱光分析仪器有限公司） 5 mL 吸量管 1 只， 2 mL 吸量管 1 只， 50 mL 容量瓶 7 只 10.0μg·mL -1 VB 2 标准溶液（置阴暗处保存），冰乙酸（ AR ）， 药用 VB 2 试样 仪器与试剂 1. 打开氙灯，再打开主机，然后打开计算机启动工作站并初 始化仪器。 2. 仪器初始化完毕后，在工作界面上选择测量项目，设置适 当的仪器参数：激发波长 = 440 nm （本仪器只有 356 nm ），发 射波长 =540 nm 。 3. 样品测定。 4. 退出主程序，关闭计算机，先关主机，最后关氙灯。 基本操作 1. 标准系列溶液的配制及标准溶液荧光强度的测定： 在六个干净的 50 mL 容量瓶中，分别吸取 0.50 、 1.00 、 1.50 ，