试验二dna的酶切电泳与southern杂交.ppt

实验目的 学习并掌握 DNA 酶切、电泳技术 学习掌握 Southern 杂交的原理和技术 实验原理 限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的 DNA 序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链 DNA 。 它可 分为三类： Ⅰ 类 和 Ⅲ 类酶 在同一蛋白 质 分子中兼有切割和修 饰 （甲基化）作用 且依 赖 于 ATP 的存在。 Ⅰ 类酶结 合于 识别 位点并随机的切割 识别 位点不 远处 的 DNA ，而 Ⅲ 类酶 在 识别 位点上切割 DNA 分子，然后 从底物上解离。 Ⅱ 类 由两种 酶组 成： 一种 为 限制性内切核酸 酶 （限制 酶 ） , 它切割某 一特异的核苷酸序列； 另一种 为 独立的甲基化 酶 ，它修 饰 同一 识 别 序列。 Ⅱ 类 中的限制性内切 酶 在分子克隆中得到了广泛 应 用，它 们 是重 组 DNA 的基 础 。 Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组 DNA 的基础。 绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为 4 至 6 个核苷酸的回文对称特异核苷 酸序列 ( 如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列： 5- G↓AATTC -3) ，有少数 酶识别更长的序列或简并序列。 Ⅱ类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割 , 产生平末端的 DNA 片段 ( 如SmaⅠ： 5- CCC↓GGG -3); 有的切割位点在对称轴一侧， 产生带有单链突出末端的 DNA 片段称粘性未端，如EcoRⅠ切割识 别序列后产生两个互补的粘性末端。 5 5 GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG EcoRI 5 G CTTAA p AATTC G 5 p 5 5 GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG EcoRI 5 G CTTAA p AATTC G 5 p 5 5 AGCT TCGA Alu I 5 AG TC p CT GA 5 p AGCT TCGA 酶切后平末端 酶切后粘性末端 DNA 纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制 性内切酶的活性。 大部分限制性内切酶不受 RNA 或单链 DNA 的影响。当微量的污染 物进入限制性内切酶贮存液中时，会影响其进一步使用，因此在 吸取限制性内切酶时，每次都要用新的吸管头。 如果采用两种限制性内切酶，必须要注意分别提供各自的最适盐 浓度。若两者可用同一缓冲液 , 则可同时水解。若需要不同的盐浓 度 , 则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用，随后调节盐浓度， 再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也可在第一个酶切反应完成 后，用等体积酚 / 氯仿抽提，加 0.1 倍体积 3mol/L NaAc 和 2 倍体积 无水乙醇，混匀后置 - 70℃低温冰箱 30 分钟，离心、干燥并重新溶 于缓冲液后进行第二个酶切反应。 酶切过程中的注意事项 在酶切过程中，为了获得条带清晰的电泳图谱，一般 DNA 用量约 为 0.5- 1μg。 限制性内切酶的酶解反应最适条件各不相同 , 各种酶有其相应的酶 切缓冲液和最适反应温度 ( 大多数为37℃)。 对质粒 DNA 酶切反应而言 , 限制性内切酶用量可按标准体系1μg DNA 加 1 单位酶 , 消化 1-2 小时。但要完全酶解则必须增加酶的用量 , 一般增加 2-3 倍 , 甚至更多 , 反应时间也要适当延长。 酶切过程中的注意事项 DNA 限制性内切酶酶切图谱又称 DNA 的物理图谱，它由一系列 位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式 表示。在 DNA 序列分析、基因组的功能图谱绘制、 DNA 的无性 繁殖、基因文库的构建等工作中，建立限制性内切酶图谱都是不 可缺少的环节，近年来发展起来的限制性片段长度多态性 (RFLP) 技术更是建立在它的基础之上。 技术应用 DNA 限制性内切酶酶切图谱 目标 DNA 片段分析 基因工程中外源 DNA 与载体的连接 目标 DNA 片段分析 基因工程中外源 DNA 与载体的连接 DNA 限制性内切酶酶切图谱 Southern 杂交 建立酶切反应体系 适量 DNA 2ul 10x 限制性内切酶缓冲液 2ul 40 mmol/L spermidine 1ul 100 mmol/L DTT 限制性内切酶 2 Ｕ /ug DNA 加 ddH2O 定容至 20ul 注意：酶、缓冲液等需置于冰上；反应中酶应该是最后 一个加入的试剂。 37 摄氏度保温 1 小时 Southern 杂交技术原理与流程 Southern 印迹杂交（ Southern blot ）是 1975 年由英国人 southern 创建， 是研究 DNA 图谱的基本技术，在遗传病诊断、 DNA 图谱分析及 PCR 产物分析等方面有重要价值。 基本原理 ：具有一定同源