生化分离与纯化技术_酵母细胞的破碎及破碎率的测定_维尼生物科技有限公司-啤酒酵母粗蛋白质制备.pptVIP

LOGO 啤酒酵母粗蛋白质制备 啤酒酵母粗蛋白质制备 产品简介 1 实训目标 2 实训原理 3 实训试剂与设备 4 生产实训 5 产品检测 6 啤酒酵母粗蛋白质制备 产品简介 啤酒酵母蛋白质含量约占其干物质的45%～55%，比大豆的蛋白质含量还要高(大豆仅含蛋白质37%～44%)，而且营养丰富，含有包括人体必需氨基酸在内的19种氨基酸.此外，还含有维生素B1,B2,B6及其它微量元素。 为了更有效地利用啤酒酵母细胞中的高蛋白质组分，从细胞中分离出蛋白质，Dunnill和Lilly提出了几种使酵母细胞释放蛋白质的方法：细胞自溶法、化学处理法、酶解法和机械破壁法。 啤酒酵母粗蛋白质制备 实训目标 1.掌握超声波破碎细胞的原理和操作； 2.学习细胞破碎率的评价方法。 实训原理 啤酒酵母粗蛋白质制备 频率超过15～20kHz的超声波，在较高的输入功率下（100～250W）可破碎细胞。本实验采用JY95-2D超生波细胞粉碎机，其工作原理是：JY92-2D超声波细胞粉碎机由超声波发生器和换能器两部分组成。超声波发生器（电源）是将220V、50Hz的单相电通过变频器件变为20～25Hz、约600V的交变电能，并以适当的阻抗与功率匹配来推动换能器工作，做纵向机械振动，震动波通过浸入在样品中的钛合金变速杆对破碎的各类细胞产生空化效应，从而达到破碎细胞的目的。 啤酒酵母粗蛋白质制备 实训试剂与设备 一、试剂和材料 1、酵母细胞悬浮液：0.2g/mL的啤酒酵母溶于50mmol/L乙酸钠-乙酸缓冲溶液（pH为4.7）。 2、马铃薯培养基 ①马铃薯（去皮切块）200g；②琼脂20g；③蔗糖20g；④蒸馏水1000mL；⑤pH为6.5。 选优质马铃薯去皮切块，加水煮沸30min，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂，融化后补充加水至1000mL，分装，115℃灭菌20min。 二、实验器材 超声波细胞破碎机，电子显微镜，酒精灯，载玻片，血细胞计数板，接种针。 啤酒酵母粗蛋白质制备 生产实训 一、生产前准备 1、检查生产原料、各种生产用试剂；2、检查生产设备；3、检查生产记录等文件 二、生产操作 1、啤酒酵母的培养 （1）菌种活化：将酵母菌种转接至斜面培养基上，28～30℃，培养3～4d，培养成熟后，用接种环取一环酵母菌至8mL液体培养基中，28～30℃，培养24h。 （2）扩大培养：将培养成熟的8mL液体培养基中的酵母菌全部转接至80mL液体培养基的锥形瓶中，28～30℃，培养15～20h。 （3）破碎前计数：取1mL酵母细胞悬浮液经适当稀释后，用血细胞计数板在显微镜下计数。 啤酒酵母粗蛋白质制备 生产实训 2、细胞超声波破碎 （1）将80mL酵母细胞悬浮液放入100mL容器中，液体浸没超声发射针1cm。 （2）打开开关，将频率设置中档，超声破碎1min，间歇1min，破碎20次。 （3）取1mL破碎后的细胞悬浮液经适当稀释后，滴一滴在血细胞计数板上，盖上盖玻片，用电子显微镜进行观察，计数。计算细胞破碎率。 3、啤酒酵母粗蛋白质制备 破碎后的细胞悬浮液，于12000r/min、4℃离心30min，去除细胞碎片。用Lowry法检测上清液蛋白质含量。 啤酒酵母粗蛋白质制备 产品检测 在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物，Folin-酚试剂中的磷钼酸盐-磷钨酸盐被蛋白质中的Tyr和Phe残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。 在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。在540 nm处测定样品吸光值，确定其蛋白质含量。 啤酒酵母粗蛋白质制备 产品检测 一、检测前准备 1、检测装置、各种检测用试剂；2、检查检测记录等文件 二、产品检测 1、试剂准备 （1）试剂A：称取Na2CO3 100.0g溶于1000 mL（最终体积）0.5 mol/L NaOH中。 （2）试剂B：称取CuSO4?5H2O 1.0 g溶于100 mL（最终体积）蒸馏水中。 （3）试剂C：称取酒石酸钾钠2.0g溶于100 mL（最终体积）蒸馏水中。 （4）牛血清蛋白（BSA）标准溶液：准确称取牛血清蛋白，配制成浓度为200 ?g/mL的溶液。 （5）2 mol/L Folin-酚试剂 啤酒酵母粗蛋白质制备 产品检测 2. 标准曲线的绘制及样品测定 （1）标准曲线的绘制 （2）试剂A 15.00 mL+试剂B 0.75 mL+试剂C 0.75 mL→在50 mL三角瓶中混匀→在每支试管中分别准确加入此试剂1.00 mL，充分摇匀，静置15min （3）分别在各试管中准确加入Folin-酚试剂稀释液3.00 mL，立刻充分摇匀 啤酒酵母粗蛋白质制备 产品检测 （4）静置45min，在540 nm波长下测定每个试管中溶液的 吸光值 （5）