美洲型prrsvgp4蛋白中和单抗的制备及其抗原表位鉴定.docxVIP

美洲型 PRRSV GP4蛋白中和单抗的制备及其抗原表位鉴定 猪繁殖与呼吸综合征病毒（ Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV ）是引起猪繁殖与呼吸综合征（ PRRS）的病原 , 我国发现 的位于 PRRSV5 亚群的 PRRSV类 NADC30株自 2013 年以来广泛流行。 PRRSV的糖 蛋白 GP4在 PRRSV感染以及产生中和抗体过程中发挥重要作用 , 但对于具有中和 活性 GP4 MAb的制备与研究却鲜有报道。 本研究目的是制备具有中和活性的 PRRSV GP4蛋白的单克隆抗体（ MAb）并 鉴定出 MAb识别的抗原表位 , 对了解 PRRSV基因组的结构与功能 , 以及进一步利用 中和单抗对 PRRS进行免疫防治具有非常重要的意义。本研究用纯化的 PRRSV SD53株病毒免疫 6 周龄的 BALB/c 雌鼠三次 , 第三次免疫 7 天后 , 经 IFA 检测结果 显示小鼠血清全部转阳。 取血清已经转为阳性的小鼠脾细胞和骨髓瘤 SP2/0 细胞进行细胞融合。经四 次亚克隆 , 并对所筛选杂交瘤细胞分泌出的抗体进行稳定性验证 , 结果表明成功 获得一株能够稳定分泌抗 PRRSV MAb的阳性杂交瘤细胞株 , 命名为 LM26;对所获 得的阳性杂交瘤细胞大量培养 , 并以这株细胞制备腹水 , 收集制备的腹水 , 经亲和 层析纯化 ,western blot 分析结果表明 , 已经获得了纯化后的 MAb。 IFA 测定 MAbLM26的细胞培养上清及腹水的效价为 1:16 和 1:1600 。该 MAb 对北美洲型 PRRSV SD53株具有中和活性 , 中和效价最低为 1:6, 最高为 1:50 。 MAb亚型为 IgG2a 亚类 , 轻链为κ链。本研究进一步明确了 LM26为抗 PRRSV GP4单抗 , 并精确鉴定其识别的抗原表位。 首先 , 将 PRRSV SD53株一系列结构蛋白的核酸序列扩增后回收 , 利用两个核 酸内切酶切开 , 并将回收后的片段连入到 pGEX-6P-1表达的载体中 , 把一系列重 组表达的质粒构建出来 , 利用这些质粒 , 进行重组蛋白的诱导和表达 , 获得了一系 列表达的结构蛋白短肽与 GST的融合蛋白。 western blot 结果显示 , 一系列重组 蛋白均成功表达 , 且 LM26仅与 PRRSV重组表达后的 GP4蛋白能够特异性的结合。 其次 , 将测序正确后的质粒 pCAGGS-FLAG-GP4瞬时转染到 293T细胞作为检测 抗原 , 用 IFA 验证已经成功表达的重组 GP4蛋白与 LM26反应 , 证明抗 PRRSV GP4 MAb已经被成功的制备。最后 , 对该 MAb识别 GP4蛋白上抗原表位进行鉴 ,western blot 结果显示 LM26识别 GP4蛋白的 aa 57supa/supa 62(sup57/supVVLQDIsup62/sup)。 将序列 sup57/supVVLQDIsup62/sup与在 GenBank中下载的 28 株国内外 PRRSV株 GP4氨基酸序列比对 , 结果显示 , 位于 GP4蛋白的 aa 57supa/supa 62 这段序列 , 在 HP-PRRSV株以及类 NADC30 PRRSV株中呈现高度保守 ; 在经典 PRRSV株中存在 2 个突变位点 , 分别是 Vsup57/supA和 Qsup60/supH;在欧洲 PRRSV株中存在 1 个突变位点 Vsup57/supM。然 ,IFA 检测结果显示 ,LM26 与疫苗株 HuN4-F112、 CH-1R、MLV、 TJM-F92反应 , 与欧洲株 DV、VP046BIS不反应 , 由此推测 Vsup57/supA、Qsup60/supH 突变不影响 LM26对抗原表位的识别 , 该表位在美洲型 PRRSV中相对保守。 综上所述 , 本研究成功制备出一株具有中和活性的抗 PRRSVGP4蛋白 MAb,并 鉴定了其识别表位位于 GP4蛋白 sup57/supVVLQDIsup62/sup,该 MAb有 助于进一步研究 PRRSV基因组的结构和功能。