基因抑制技术.docVIP

基因敲除：是通过八定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除 主要是应川DNA同源重纽原理，川设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的 忖的。随着基因敲除技术的发展，除了同源重纽?外，新的瓯理和技术也逐渐被应丿〕］,比较成 功的有基因的插入突变和iRNA,它们同样可以达到基因敲除的目的。 RNA干扰是与靶基因同源的双链RNA诱导的特异转录后基因沉默现象。其作用机制是双链 RNA被特异的核酸酶降解，产生干扰小RNA(siRNA),这些siRNA与同源的靶RNA互补结合， 特异性酶降解靶RNA,从而抑制、下调基因表达。U经发展成为基因治疗、基因结构功能研 究的快速而有效的方法。 RNA干扰技术的原理和应用 马鹏鹏薛社普韩代书 (屮国医学科学院基础医学研究所，中国协和医科大学基础医学院细胞生物学系，北京100005) 并常单忸RNARdRP公化孩隈IW降轿mRNA图1 RNAi作用机制I 并常单忸RNA RdRP公化 孩隈IW降轿mRNA 图1 RNAi作用机制 I I匕此【1 ] 以siRNA为引物RdRP値化令成新的取饪RNA + IHcer 1 ： 1 I 外源収僅RNA 狀聲収链RNA 其他取51 RNA * Dicer 双绻siRNA / 丄 p / A 符异性邀白结合.$iRNA解址 d P 恬化的朋NA X白H合体、RISC 1111 G f I 11 i …… nANA 双徒RNA RNAi是山双链RNA所引起的序列特界性基因沉默。RNAi首先山Fire等发现于秀丽隐杆线虫(C. elegans) 屮，他们发现将dsRNA注入线虫体内丿G打抑制序列同源基因的表达，并证实这种抑制主要作用于转录之后, 所以又称RNAi为转录后基因沉默(postt ranscriptional gene silencing ,PTGS)。随后人们陆续在果蝇 (Drosophila)、锥虫(Trypanosomes)、涡虫(Planaria)、斑马鱼(Zebrafish)、拟南芥(Arabidopsis thaliana).大小鼠和人体内发现了 RNAi现象，遗传学研究表明RNAi是真核生物中一种普遍存在且非常 保守的机制，与真核细胞屮许多或要生物学过程密切相通过对RNAi现象的遗传学与生物化学研究，其作用 机制已II渐清晰(见图1)。Zamore等利用果蝇胚胎提取物建立的体外系统，证实RNAi是一个依赖ATP 的过程，在此过程屮，dsRNA (外源的或体内产生的)首先被降解为具5“2单磷酸、长21 -23bp的小分子 双链RNA ,这种RNA分子称为小干扰RNA , siRNA通过碱基互补配对识别具同源序列的mRNA ,并介导 其降解。研究表明在生物体屮siRNA具相似的结构特征：为长约21?23bp的双链RNA ,具5”单磷酸和 3”轻基末端，互补双链的3”端均有一个2、3nt的单链突出。在RNAi过程中一种称为Dicer的核酸悔负责 将dsRNA转化为siRNA ,它属于RNase川家族，具有两个催化结构域、一个解旋helicase)结构域和一 个PAZ ( Piwi/ Argonaute/ Zwille )结构域，Dicer右准化过程中以二聚体的形式出现，其催化结构域在 dsRNA上反平行排列，形成四个活性位点，但只有两侧的两个位点令内切核酸酚活性，这两个位点在相距 约22bp的距离切断dsRNA,各种纶物体内Dicer结构略有不同，致使siRNA长度存在微小差别。siRNA 形成之后，与一系列特异性蛋口结合形成siRNA诱导十扰复合体(siRNA induced interference complex , RISC)，此复 合物通过碱基 互补配对识别 靶mRNA并 使其降解，从 而导致特定基 因沉默。在 RISC中，起 靶序列识别作 用的是siRNA 的反义链， Zamore等发 现在RNAi过 程中，首先产生 的是RISC无 活性前体，分 子M-250kD , 当加入ATP 后可形成100kD的活性复合体。山无活性前体向活性酶复合物的转换类似蛋白酶原的激要求结合于其上的 siRNA双链的解开。在ATP存在时,依赖于ATP的解旋酶解开siRNA的双链并将其正义链与靶mRNA置 换，mRNA取代正义链与反义链互补,然后由活化的RISC在互补区的中间,距离siRNA反义链3味端约 12bp处切断靶mRNA序列。RNAi效应具有两个明显的特征，特异性和高效性。干扰的高效性提示在机制 屮存在信号放人的步骤。Fire等早在1998年便发现少量的dsRNA就能够导致线虫人量的靶mRNA降解， 但单凭少M dsRNA被Dicer降解为几十个siRNA并不能解释这种高效性。许多研究显示RNAi过程中有 新的dsRN