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2021/3/14 * 鸟枪法克隆目的基因的局限性 工作量较大;不能除去真核生物目的基因的内含子结构 2021/3/14 * 鸟枪法操作的改进 在连接前将DNA片段进行分级分离 例如,已知某目的基因位于1.8 kb的SalI片段中,将染色体DNA用SalI切开,琼脂糖凝胶电泳分离,用刀片切下相当于1.6 - 2.0 kb大小区域内的凝胶块,从此凝胶块中回收DNA片段,然后与载体进行拼接。 2.0 kb 1.6 kb 1.8 kb 2021/3/14 * cDNA法 寡聚dT, 32P-dNTP 32P标记的cDNA探针 杂交,显影 寡聚dT, 32P-dNTP 32P标记的cDNA探针 杂交,显影 对照材料 处理材料 分离polyA mRNA 分离polyA mRNA 构建cDNA文库 从原平板克隆中分离cDNA 差示杂交筛选克隆新基因 2021/3/14 * PCR法 使用PCR法克隆目的基因的前提条件是: 已知待扩增目的基因或DNA片段的部分序列, 根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物。 克隆程序:A/T克隆 2021/3/14 * 化学合成法 全基因合成 2021/3/14 * 2021/3/14 * 2021/3/14 * 上述三种方法各有利弊:化学合成DNA的单片段愈短,收率就愈高,但由于化学合成的份额较大,成本较高;在大片段酶促法合成目