2021年分子生物学考点整理4Protein Science.docVIP

PAGE 1 4.陈勇老师 蛋白质科学 本文档由段佳整理，希望各位同学都能取得好成绩! Protein Science——陈勇 第一节概述 一、蛋白质的结构组成 一级结构：氨基酸序列； 二级结构：α螺旋 、310 螺旋 、π螺旋、β-折叠、β-转角，超二级结构是由两个以上二级结构组成的motif； 三级结构：指由二级结构元件构建成的总三维结构，包括一级结构中相距较远肽段之间的几何相互关系和侧链在三维空间中彼此间的相互关系； 四级结构：蛋白质分子或复合物的多亚基结构和分子聚合体 。 二、蛋白质特点总结： 蛋白质是由氨基酸按照特定序列连接通而成的生物大分子；具有一定的分子质量和电荷，复杂的分子结构和生物学功能。 蛋白质的生化特性分析方法： 1组成： 酸水解，6M HCl，105℃，18h，打断所有的肽键，HPLC分析； 序列分析：Edman 降解，MASS 蛋白酶水解，将蛋白水解为多肽，用质谱进行分析 2质量： 绝对质量：沉降分析，静态光散射分析 相对质量：SDS，凝胶过滤 蛋白浓度测定：Nitrogen content (16%) Kjeldahl test 凯氏定氮法 Regularly used methods: UV absorption at 280 nm (aromatic residues:WY); 205-220nm (peptide bond) Dye binding (Bradford) Bis-cinchonic acid (BCA) reagent Lowry-Folin-Ciocaleau reagent Biuret-alkaline copper reagent 碱性铜试剂双缩脲法 3电荷：等电点测定：等点聚焦法； 2D电泳法：一维先利用等点聚焦法分离（等电点分离），二维采用SDS page 分离（质量） 4 结构： 蛋白质的稳定性： Thermal shift assay 蛋白质热转移技术 差示扫描量热法（DSC） 差示扫描量热法（differential scanning calorimetry,DSC），一种热分析法。在程序控制温度下，测量输入到试样和参比物的功率差（如以热的形式）与温度的关系。 差示扫描量热仪记录到的曲线称DSC曲线，它以 样品吸热或放热的速率，即 热流率dH/dt（单位毫焦/秒）为纵坐标，以温度T或时间t为 横坐标，可以测定多种热力学和动力学参数，例如 比热容、 反应热、转变热、 相图、 反应速率、 结晶速率、高聚物结晶度、样品纯度等。 蛋白质二级结构： circular dichroism （CD），圆二色 用于推断非对称分子的构型和构象的一种旋光光谱，是研究稀溶液中蛋白质构象的一种快速、简单、较准确的方法。它可以在溶液状态下测定，较接近其生理状态。而且测定方法快速简便，对构象变化灵敏，所以它是目前研究蛋白质二级结构的主要手段之一，并已广泛应用于蛋白质的构象研究中。 结构解析研究： Main techniques in Structural Biology X-ray macromolecular crystallography Solution nuclear magnetic resonance (NMR) Electron cryomicroscopy (Cryo-EM) Theoretical modeling Others: small angle X-ray scattering, electron diffraction, mass spectrometry etc. 5功能： 蛋白质修饰：乙酰化、泛素化、甲基化、磷酸化…… 利用质谱分析探测蛋白质修饰 第二节蛋白纯化与相互作用研究 一、蛋白纯化 1 Different solubilities 盐析：盐或有机分子可逆沉淀。大多数蛋白质在高盐浓度下溶解性较差，这种效应称为盐析。 蛋白质沉淀的盐浓度因蛋白质而异。 因此，盐析可用于分离蛋白质。透析可以用来去除盐。 (NH4)2SO4：最常用，便宜，溶解度高，不会导致蛋白变性 2 Different sizes ①Differential centrifugation as a first step in protein purification ②Dialysis – Separation based on size 通常用于将蛋白与小分子分离 ③Size Exclusion (gel-filtration) chromatography 分子排阻色谱，主要根据凝胶孔隙的孔径大小与高分子样品分子的线团尺寸间的相对关系而对 溶质进行分离的分析的方法，大分子先出峰，小分子后