2021年分子生物学考点整理10转录调节.docVIP

PAGE 1 9.王纲老师 转录调控 本文档由宁怡和朱洪梅整理，希望各位同学都能取得好成绩! 转录调控——王纲 内容： 一．基因调控的重要性：转录因子与细胞命运 二．启动子的结构 三．转录因子的结构 四．转录起始阶段 五．Mediator复合物与转录 六．转录延伸阶段 七．ChIP-seq技术 八．展望 基因转录是一个多因子参与、多步骤发生的复杂生物过程。参与这个过程的蛋白因子大致可分为三大类:第一类为RNA聚合酶II(polII)和基本转录因子(GTFs),它们结合在靶基因的启动子上,形成前起始复合物(PIC),启动基因的转录;第二类为调节蛋白(如激活因子和抑制因子),它们是一类与靶基因启动子和增强子特异结合的转录因子,具有细胞及基因特异性,可以增强或抑制靶基因的转录;第三类是协调因子,它们往往在转录因子和前起始复合物之间发挥桥梁作用。另外,这些因子还可以改变局部染色质的构像,对基因转录的起始具有推动作用。 基因调控的重要性：转录因子与细胞命运 1. 细胞分化与重编程 2012年诺贝尔奖：John B. Gurdon, Shinya Yamanaka Gurdon的实验：紫外失活青蛙卵的细胞核，重新转入青蛙小肠上皮细胞的细胞核，培养以后卵细胞发育为性成熟成体青蛙。 Yamanaka的实验：将Oct4, Sox2,Klf4, cMyc四种转录因子转入小鼠成纤维细胞，得到诱导多能干细胞（iPS）； 分化 分化 重编程干细胞 体细胞 重编程 体细胞 干细胞 意义：可从病人身上获得皮肤细胞，重编程，在实验室进行检测以确定它们与健康人体细胞的不同。这些细胞为理解疾病机制提供了无价的工具，为细胞治疗提供了新的细胞来源，为开发新的药物及医学疗法提供了新机会。 细胞分化的本质就是细胞内的基因在不同发育阶段选择性表达的结果，而调控基因表达的主要调节因子是转录因子。 基因表达的调控的重要性 细胞的功能主要是由其中的大分子表现出来的； 细胞类型或者细胞生长环境不同，则细胞内的大分子种类及水平也不同； 基因表达异常（表达量、表达时间、表达位置）能引发疾病； 启动子结构 基因的顺式作用元件（可理解为调控基因表达的特殊序列） 多细胞生物的基因含有TATA-box、增强子（enhancer）、启动子近侧元件（promoter-proximal element）以及核心启动子序列； 增强子对基因的调控不受距离、位置和方向的影响，长距离的调控是通过形成loop来实现的； 很多酵母基因不含内含子，而且调控序列只有上游激活序列UAS（upstream activating sequence）和TATA-box； 在多细胞生物里，标准的启动子近侧元件指的是GC-box(序列多为GGGCGGGC) Promoter-proximal元件：启动子近侧元件（紧接启动子的DNA序列，与蛋白质结合而调节基因转录的遗传序列）。在多细胞生物里，标准的Promoter-proximal元件是指GC-box（基因上游的富含GC的序列，较保守，通常为GGGCGGGC）被转录因子SP1识别；SP1属于Sp1/Krüppel样转录因子家族，通过锌指结构与DNA上富含GC的DNA元件特异性结合，调节转录，参与调节细胞功能，如细胞增生、凋亡、分化和肿瘤形成。 2. 转录起始位点确定 (1). S1核酸酶保护法：含有目的mRNA的RNA样品与互补的DNA或RNA探针温育，探针序列的5’端用32P标记。核酸酶S1降解未杂合的单链RNA和DNA，余下的DNA-RNA或RNA-RNA杂合体用变性胶——聚丙烯酰胺-尿素凝胶，电泳分离，接着用自显影观察，通过标记片段的长度，即可知道转录起始位点。 (2). 引物延伸分析：引物延伸实验可标定转录产物的5’-端， 确定转录的精确起始。特异的末端标记的引物退火到RNA链的互补区域，随后用RNA作为模板，用反转录酶延伸引物得到cDNA，用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析cDNA。cDNA的长度为引物的标记的核苷酸到RNA-5’末端间的碱基数。 3. 启动子分析方法（promoter analysis）：共转染实验（co-transfection assay） 将含有转录起始位点前不同长度的一系列片段分别与报告基因（eg:荧光素酶Luciferase和β 将含有转录起始位点前不同长度的一系列片段分别与报告基因（eg:荧光素酶Luciferase和β-半乳糖苷酶 β-galactosidase）相连接，转染大肠杆菌，根据报告基因是否表达以及表达量的多少确定promoter的位置和长度。 核心启动子元件： 4.转录因子的分离纯化：各种层析（可略过） 转录起始前复合物（pre-initiation-co