吸光光度法介绍.ppt

2021/3/14 * 光电比色法 通过滤光片得一窄范围的光(几十nm) 光电比色计结构示意图 灵敏度和准确度较差 2021/3/14 * 10.5.2、示差吸光光度法（示差法） 普通分光光度法一般只适于测定微量组分,当待测组分含量较高时，将产生较大的误差。需采用示差法。即提高入射光强度，并采用浓度稍低于待测溶液浓度的标准溶液作参比溶液。 设:待测溶液浓度为cx，标准溶液浓度为cs(cs < cx)。则: Ax= εb cx As = εb cs ΔＡ＝Ａx －Ａs =εb(cx － cs ）=εbΔc 测得的吸光度相当于普通法中待测溶液与标准溶液的吸光度之差ΔＡ。 示差法测得的吸光度与Δc呈直线关系,由标准曲线上查得相应的Δc值,则待测溶液浓度cx :cx = cs + Δc 2021/3/14 * 示差法标尺扩展原理: 普通法: cs的T=10%;cx的T=5% 示差法: cs 做参比,调T=100% 则： cx的T=50% ;标尺扩展10倍 2021/3/14 * 例题 已知 dT = 0.01, 样品Tx = 2.00 %, 标准 Ts = 10.0 % 示差法 常规法误差 示差法误差 已知 dT = 0.01, 样品Tx = 2.00 %, 标准 Ts = 5.00 % 2021/3/14 * 10.5.3、双波长分光光度法 不需空白溶液作参比;但需要两个单色器获得两束单色光(λ1和λ2);以参比波长λ1处的吸光度Aλ1作为参比,来消除干扰。在分析浑浊或背景吸收较大的复杂试样时显示出很大的优越性。灵敏度、选择性、测量精密度等方面都比单波长法有所提高。 ΔA ＝Aλ2 －Aλ1 ＝ (ελ2 －ελ1)b c 两波长处测得的吸光度差值ΔA与待测组分浓度成正比。ελ1和ελ2分别表示待测组分在λ1和λ2处的摩尔吸光系数。 2021/3/14 * 关键问题: 测量波长λ2和参比波长λ1的选择与组合 以两组分x和y的双波长法测定为例: 设:x为待测组分,y为干扰组分，二者的吸光度差分别为: ΔAx和ΔAy，则该体系的总吸光度差ΔAx+y为： ΔAx+y = ΔA x + ΔA y 如何选择波长λ1 、λ2有一定的要求。 2021/3/14 * 选择波长组合λ1 、λ2的基本要求是: ⑴选定的波长λ1和λ2处干扰组分应具有相同吸光度,即: ΔAy = ΔA yλ2 － ΔA yλ1 = 0 故: ΔAx+y = ΔA x=(εxλ2－εxλ1)bcx 此时：测得的吸光度差ΔA只与待测组分x的浓度呈线性关系，而与干扰组分y无关。若x为干扰组分，则也可用同样的方法测定y组分。 ⑵在选定的两个波长λ1和λ2处待测组分的吸光度应具有足够大的差值。 可采用作图法选择符合上述两个条件的波长组合。 2021/3/14 * 10.5.4、导数光度分析法 导数分光光度法在多组分同时测定、浑浊样品分析、消除背景干扰、加强光谱的精细结构以及复杂光谱的辨析等方面,显示了很大的优越性。 利用吸光度(或透光度)对波长的导数曲线来进行分析: Ｉ＝Ｉ0 e-εbc 假定入射光强度Ｉ0 在整个波长范围内保持恒定: dI 0 /dλ＝0 则：dI/dλ＝－Ｉ0 bc e -εbc dε/dλ ＝－Ｉ bc dε/dλ 2021/3/14 * dI/dλ ＝－Ｉbc dε/dλ 一阶导数信号与试样浓度呈线性关系; 测定灵敏度依赖于摩尔吸光系数对波长的变化率dε/dλ。吸收曲线的拐点处dε/dλ最大,故其灵敏度最高(见图）。 同理可以导出其二阶和三阶导数光谱（略） 2021/3/14 * 10.6 吸光光度分析法的应用 1. 单一组分测定 1) 金属离子: Fe-phen, Ni-丁二酮肟, Co-钴试剂 2) 磷的测定: DNA中含P～9.2%, RNA中含P～9.5%, 可得核酸量. H3PO4+12(NH4)2MoO4+21HNO3 =(NH4)3PO4·12MoO3+12NH4NO3+12H2O 磷钼黄(?小) 磷钼(V)蓝(?大) Sn2+ 2021/3/14 * 3) 蛋白质测定—溴甲酚绿、考马司亮蓝等 4) 氨基酸测定—茚三酮(紫色化合物) 5) 水质检测: NH4+、NO2-、Mn2+、Fe2+、SO42-、Hg2+---- 6) 药物含量测定—比吸光系数定量;荷移