慢病毒载体构建步骤研究.docxVIP

一、简介 慢病毒( Lentivirus )载体是以 HIV-1 (人类免疫缺陷 I 型病毒)为基础发展起来的基 因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体， 它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。 慢 病毒载体的研究发展得很快， 研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主 染色体上，从而达到持久性表达。 目前慢病毒也被广泛地应用于表达 RNAi 的研究中。由于有些类型细胞 脂质体转染效果 差，转移到细胞内的 siRNA 半衰期短，体外合成 siRNA 对基因表达的抑制作用通常是短暂 的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达 siRNA 的载体 , 然后转 移到细胞内转录 siRNA 的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达 抑制效果也不逊色于体外合成 siRNA ，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期 阻断基因表达的作用。 慢病毒载体能够产生 表达 shRNA 的高滴度的慢病毒 ，在周期性和非 周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达 shRNA ，实现在多种类型的细胞 和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默， 为在原代的人和动物细胞组织中快速 而高效地研究基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。慢病毒作为 siRNA 的携带者，不但具备特异性地使基因表达沉默的能力，而且充分发挥了慢病毒载体 自身所具备的优势，为基因功能的研究提供了更强有力的工具。 在所构建的siRNA表达载体中，是由 RNA聚合酶川启动子 来指导RNA合成的，这 是因为RNA聚合酶川有明确的起始和终止序列， 而且合成的RNA不会带poly A尾。当RNA 聚合酶川遇到连续 4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物 3端形成1~4个 U。 U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶川依赖的启动子，其特点是启动子自身元素 均位于转录区的上游，适合于表达? 21ntRNA 和?50ntRNA 茎环结构(stem loop )。在 siRNA 表达载体中，构成 siRNA 的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录 ,然后两条链 互补结合形成 siRNA ；也可由载体直接表达 小发卡状 RNA (small hairpin RNA, shRNA), 载 体包含位于RNA聚合酶川启动子和 4?5T转录终止位点之间的茎环结构序列， 转录后即可 折叠成具有 1~4 个 U 3 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成 siRNA 。构建载体前 通常要通过合成 siRNA 的方法，寻找高效的 siRNA ，然后从中挑选符合载体要求的序列， 将其引入 siRNA 表达载体(筛选)。 二、实验流程(大致的简单过程) 慢病毒表达载体包含了 包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息 。慢病毒包装质粒可 提供所有的转录并包装 RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。 为产生高滴度的 病毒颗粒，需要利用 表达载体（自己构建）和包装质粒（购入） 同时共转染细胞，在 293T细 胞（购入）中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清 液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后， 经过反转录，整合到 基因组，从而高水平的表达效应分子。 大致的实验流程： 根据目的基因相关信息（序列，序列号等），构建含有外源基因或 siRNA的重组载 体；（即质粒构建，已构建好，质粒可以永久保存） 对于测序正确的重组质粒，提取和纯化高质量的 不含内毒素的重组质粒； 使用高效 重组载体和病毒包装质粒（购入） 共转染293T细胞［1］，进行病毒包装和 生产，收集病毒液； 浓缩、纯化病毒液； 用高质量的病毒液感染细胞 （293T细胞）； 通过定量PCR精确测定病毒滴度（高精确滴定方法）和 Western分析实验结果； 用高质量的病毒液感染宿主细胞 ；检测基因功能或者 siRNA的沉默效率以及使用药 物进行稳定转染细胞株的筛选， 通常状况下，筛选的细胞克隆株具有长期的表达稳定性。 病 毒液足够用于一般的动物活体实验。 三、重组质粒构建流程 基因的获得：shRNA寡核苷酸序列的设计和合成 （将正确序列克隆入载体中，退火形成双 链，PCR扩增） 回收 A .酶切产物的胶回收：一般做 50-100ul体系，然后跑电泳回收，回收量一般为 30ul。 B . PCR扩增产物的胶回收 原理：首先利用低熔点琼脂糖凝胶电泳 DNA片段，分离目的条带 DNA，然后紫外光 DNA片段。试剂盒的胶回收DNA、RNA DNA片段。试剂盒的胶回收 DNA、RNA的原理，配 柱采用特殊硅基质材料在一定的高盐缓冲系统下高效、专一地吸附 备设计独特的离心吸附柱式结构,使用常规台式高速离心机,在几分钟之内即可以高