dna体外合成与序列测定.pptVIP

DNA的体外合成;1. 合成的原理 核酸固相合成的基本原理是将所要合成的核酸链的末端核苷酸先固定在一种不溶性高分子固相载体上，然后再从此末端开始将其他核苷酸按顺序逐一接长。 每接长一个核苷酸残基则经历一轮相同的操作，由于接长的核酸链始终被固定在固相载体上，所以过量的未反应物或反应副产物可通过过滤或洗涤的方法除去。 合成至所需长度后的核酸链可从固相载体上切割下来并脱去各种保护基，再经纯化即可得到最终产物。 ;DNA的化学合成 合成的原理 核酸固相磷酰亚胺法合成时，末端核苷酸的3′-OH与固相载体成共价键，5′-OH被4，4′-二甲氧基三苯甲基(DMTr)保护，下一个核苷酸的5′-OH亦被DMTr保护，3′-OH上的磷酸基上有 -N(C3H7)2和-OCH3两个基团。;*;DNA的化学合成 2. 合成后处理 合成后的寡核苷酸链仍结合在固相载体上，且各种活泼基团也被保护基封闭着，要经过以下合成后处理才能最后应用。 切割：合成的寡核苷酸链仍共价结合于固相载体上，用浓氨水可将其切割下来。切割后的寡核苷酸具有游离的3′-OH。 脱保护：切割后的寡核苷酸磷酸基及碱基上仍有一些保护基，这些保护基也必须完全脱去。磷酸基的保护基β-氰乙基在切割的同时即可脱掉，而碱基上的保护基苯甲酰基和异丁酰基则要在浓氨水中55℃放置15h左右方能脱掉。 纯化：纯化的目的主要是去掉短的寡核苷酸片段，盐及各种保护基等杂质。通常采用的纯化方法有电泳法、高效液相色谱法和高效薄层色谱法等。纯化这一步操作是可以选择的，对要求不高的应用如PCR等可不纯化。 近年来发展了一些修饰试剂，可在合成寡核苷酸时，对某些核苷酸进行一定的修饰，为寡核苷酸探针的非放射性标记提供了新途径。 ;第二节 DNA的体外合成;聚合酶链式反应（PCR） PCR的原理： 原理类似于DNA的天然复制过程。即在模板DNA、寡核苷酸引物、四种脱氧核糖核苷酸（dNTP）底物和Mg2+存在的条件下，由耐热的TaqDNA聚合酶催化DNA的复制，合成靶DNA。PCR包括三个基本过程： 变性。加热模板使其解离成单链。 退火。降低温度使人工合成的寡核苷酸引物与模板 DNA 中所要扩增的靶序列的两侧按碱基配对原则相结合。 延伸。在适宜条件下，TaqDNA聚合酶利用dNTP使引物3′端向前延伸，合成与模板碱基完全互补的DNA链。这样变性、退火和延伸构成一个循环，每一次循环的产物可作为下一次循环的模板，经过30～35个循环后，界于两个引物之间的靶序列得到大量复制，拷贝数约增加106～107倍。;*;核酸序列测定;Sanger双脱氧链终止法;Sanger双脱氧链终止法原理;核酸序列测定;反应：同时加入引物和模板、DNA聚合酶1、一种ddNTP、以及 四种dNTP（有一种带放射性标记）。 变性胶电泳分离反应混合物。 放射自显影术，检测单链DNA片段的放射性带。 结果判读，从放射性X光底片上，直接读出DNA的核酸顺序。;Sanger双脱氧链终止法 基本原理： 测序所用的ddNTP ddNTPs 是反应终止剂，可以当作正常碱基参与复制，一旦链入DNA中，其后就不能再继续连接。反应体系中dNTPs的浓度远高于ddNTPs（一般1：3~4）。 ;Sanger双脱氧链终止法 基本步骤： 测序模板的纯化与定量 测序反应—PCR仪 测序反应产物纯化与变性 上样电泳—测序仪 分析结果 ;*;*;Sanger双脱氧链终止法 测序结果：;DNA测序仪的多种应用：;Sanger双脱氧-M13体系 DNA序列分析法;这些供作序列测定的DNA片段绝大多数都仅为数百个核酸。因此需要用物理方法分离大量的DNA片段。费时费钱，因为商品提供的核酸内切限制酶的价格是十分昂贵。为了保证能够获得所有的限制片段，就需要制备足多数量的DNA，而其中有许多步骤都要用不同浓度的凝胶进行电泳再纯化。在这种纯化过程中，会加剧DNA的损伤和丢失。;克服缺点的一种途径—DNA分子克隆;M13载体克隆DNA片段;当然这种随机的方法，也需要通过顺序的测定将派生的序列拼连起来，恢复成原来结构形式的总DNA序列。;荧光标记物;聚合反应及产物;;核酸序列测定;Maxam－ Gilbert化学修饰法的原理;出发材料：局部消化的DNA分子群体中纯化出特定的末端带有放射性标记的DNA片段 (双链或单链） 关键：4种核苷酸碱基中，有1～2种发生特异性的化学切割仅应，包括碱基的修饰、修饰的碱基从其糖环上转移出去以及在失去碱基的部位发生DNA链的断裂三个主要的内容。由于化学切割反应特异性是由碱基的修饰作用决定的，显然，随后的切割反应必定是定量的，而且同副反应无关。;Maxam-Gilbert DNA化学降解法 基本原理： ;Maxam－Gilbert化学修饰法优点;Maxam