生物实验实时定量pcr实验报告.docx

精品文档 精品文档 实验四 定量 PCR 扩增 姓名：李宗翰 专业：环境工程 学号： 1432999 同组人姓名：刘雪飞 一、实验目的 复习定量 PCR 原理，熟悉绝对定量的操作流程 二、实验原理 实时荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积 实时监测整 PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在 PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，通过 Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析 三、 实验仪器及材料 real time PCR仪（ABI7500, RotorGene 3000）,微量移液器，Tip 头，0.2ml 光学薄 壁管，8联PCR管，1.5ml离心管，SYBR Mix，引物及108 copy/ul标准品 四、 实验步骤 1、标准样品稀释：取4个1.5ml的离心管，写上标记107， 106, 105, 104，向每 管加入90卩l ddH2O,取10卩l 108 copy/ul的标样加入到107管中，充分混匀 后，从管中取10卩l 107 copy/ul的液体到106管中。按上述操作依次稀释，得到 5个倍数的标准样品。注意，每次稀释都要换 Tip头。 2、 配制预混液：取119卩l ddH2O、7卩l引物4204f、7卩l引物4448r和7卩l Rox 到装有175卩l SYBR Mix液的1.5ml离心管中，混匀。 3、 分装预混液：取 7 个小离心管，分别标记 108、 107、 106、 105、 104、 UNK （未知样）、NTC （阴性对照）。向其中分别加入42卩l预混液和4.7卩l模板（1-5 号加标样、 6 号加未知样、 7 号加等量 ddH2O） ，混匀。 4、 戴上手套取两个8联管，并排放置管架上。分别取上述样品 20卩l至第1-7 管中（第 8管空出），每个样品两个重复， 共14个样品。将加好样的 8联管振荡。 5、 设置分析仪参数如下：95T 3min； 95C 15s+60C 40s为一个循环，循环次 数40,融解曲线温度范围60~95T。振荡好的样品进机进行 PCR扩增。 6、 扩增后利用软件分析 CT 值及未知样的定量结果。 五、实验结果与讨论 1、实验结果如何？试分析 答：实验结果及分析如下。 、实验具体数据见下表 其中，A-E 其中，A-E为标准样品，F为位置样品, G为阴性对照。每个样品做两个平行。 Quan tity Ct Well Task Ct Ct Mean Ct SD Qua ntity Mea n Qua ntity SD Threshold A1 STANDARD 8.2488 8.2527 0.0055 100000000 0.0712 A2 STANDARD 8.2565 8.2527 0.0055 100000000 0.0712 B1 STANDARD 11.3893 11.6598 0.38250.0712 B2 STANDARD 11.9303 11.6598 0.38250.0712 C1 STANDARD 15.3292 14.9668 0.5126 1000000 0.0712 C2 STANDARD 14.6043 14.9668 0.5126 1000000 0.0712 D1 STANDARD 19.4912 19.3080 0.2590 100000 0.0712 D2 STANDARD 19.1249 19.3080 0.2590 100000 0.0712 E1 STANDARD 22.5385 22.4196 0.1681 10000 0.0712 E2 STANDARD 22.3007 22.4196 0.1681 10000 0.0712 F1 UNKNOWN 8.9370 8.9691 0.045458302584 1695285.625 0.0712 F2 UNKNOWN 9.0012 8.9691 0.045458302584 1695285.625 0.0712 G1 NTC 32.5329 0.0712 G2 NTC 32.9549 0.0712 通过软件分析，由标准曲线得到的未知样品的定量结果约为 5.83X 107 、扩增曲线 A-npIfl^lDriPlu A-npIfl^lDriPlu QtQ QQIQQ 1 B l-F B ■ ! I I ■ ■ ■ ? ! V ■ B 1 -I A ■ 日 目 戸 丄 谚 肯 盂 避 皿 遏3 ? 試|! 於 A ■ 關 如IE ■- ■ a 日■亡■三?f?g?h 从扩增曲线中可以看出，样品均经历了良好的扩增过程。