基于脾虚证相关基因功能鉴定的小肠上皮细胞RNA干扰转染条件研究.docVIP

时间： TIME \@ yyyy年M月d日 2021年3月13日 学海无涯 页码：第 PAGE 1页共 NUMPAGES 1页 PAGE PAGE 1 基于脾虚证相关基因功能鉴定的小肠上皮细胞RNA干扰转染条件研究 RNA干扰(RNA interference，RNAi)是真核生物中普遍存在的一种自然现象，是由双链RNA(double stranded RNA，dsRNA)启动序列特异的转录后基因沉默过程，是生物体在进化中形成的一种内在基因表达的调控机制。Fire等[1]首次在线虫中发现RNAi现象，后来大量的研究表明，RNAi广泛存在于真菌、植物和动物中，由此人们认识到RNAi技术作为研究基因功能的一种有力的革命性工具，在功能基因组、转基因动物研究、基因治疗、药物开发等方面有着巨大的潜力[2-3]。目前RNA干扰技术在国内外已成为研究基因功能最常用的技术之一。 　　影响RNA干扰效率的主要因素是小型干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)的序列及转染效率，而控制不同的干扰效率可建立模拟靶蛋白不同表达水平的细胞模型。因此，对转染条件的控制有利于获得对目的蛋白表达不同干扰程度的细胞模型。而影响转染效率的关键是转染试剂和siRNA的比例，但不同种类的细胞该比例是不同的。小肠上皮细胞6(IEC6)细胞株是Quaroni等[4]研究建立的，其来源于新生的正常大鼠小肠，在组织学和免疫学方面具有隐窝样上皮细胞的特征，为未分化的上皮干细胞，无特异性基因表达及无致瘤性。目前将RNAi技术应用到肠上皮细胞的研究国内较少报道。本实验室近年来以IEC6细胞株用于消化系统疾病的体外相关研究[5-7]。为在该细胞上开展RNAi的脾气虚证相关基因的功能研究，本实验采用荧光显微镜和流式细胞仪观察转染效率的方法，优化阳离子脂质体转染siRNA进入IEC6细胞的条件，为后续实验提供参考。现报道如下。 　　1材料与方法教育教学论文发表 　　11细胞株IEC6细胞株(CRL1592)购自The American Type Culture Collection(ATCC)，LOT：4785615。 　　12主要试剂与仪器Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)、Fetal Bovine Serum(FBS)均为GIBCO公司产品，胰酶Trypsin(1∶250)为Amresco产品，乙二胺四乙酸二钠(EDTA2Na·2H2O，分子量37224)由广州威佳科技有限公司提供，Albumin及Bovine为Genebase产品，牛胰岛素(insulin)为Sigma产品，Ncontrol05815FAM(No.2005815122174)购自广州市瑞博生物科技有限公司，转染试剂LipofectamineTM2000(Cat.No.11668027)、OptiMEM(Cat.No.31985062)均由Invitrogen公司提供。IX71型相差荧光倒置显微镜为Olypums公司产品，ALTRA EPICS型流式细胞仪为贝克曼尔特实验系统(苏州)有限公司广州分公司产品。 　　13细胞培养取液氮保存的IEC6细胞37℃水浴使其迅速融化后，将冻存液转移至离心管内，3000 r/min离心5 min，去上清液，加入2 mL DMEM完全培养液(体积分数90%DMEM+体积分数10%胎牛血清+4 mmol/L L谷氨酰氨+01 U/mL牛胰岛素+10 mmol/L HEPES)重新悬浮沉淀的细胞，接种于培养瓶，体积分数10%CO2、90%空气，饱和湿度下37°C培养，次日换液。至80%左右融合时，用25 g/L胰酶053 mmol/L EDTA消化传代。 　　14种植细胞待培养瓶内IEC6细胞生长至80%~90%时，胰酶消化细胞，制作单细胞混悬液，按1×105 cells/mL，每孔1 mL密度种植到24孔培养板上，以保证第2天生长至60%。 　　15转染siRNA片段以定量的OptiMEM稀释Lipofectamine 2000，用加样枪轻轻混匀后，室温下孵育5 min(a液)。用定量的OptiMEM稀释FAMsiRNA，用加样枪轻轻混匀(b液)。将a液与b液充分混匀，室温下孵育20 min(c液)。将c液加到合适的细胞培养板中，另外每孔加入05 mL不含血清的培养基，轻轻摇晃培养板以混匀，然后在37 ℃、体积分数10%CO2条件下孵育细胞，5 h后更换为含体积分数10%血清的完全培养基，再放回培养箱继续培养。 　　16荧光显微镜检测转染效率设置FAMsiRNA(A)0、40、80、160 nmol/L组，同时Lipofectami