大肠杆菌基因工程3.pptxVIP

基因工程 Genetic Engineering;第三章 大肠杆菌基因工程;四、工程菌构建、分析、发酵与产物分离纯化;工程菌构建 发酵工艺研究 分离纯化工艺研究; 工程菌构建研究内容与技术路线;1、目的蛋白分析： 糖基化？难表达？难复性？药用？ 1)理化特性() *分子大小：≤5KD、≥100KD难表达（融合表达、截短表达） *氨基酸组成：Cys、Pro多的难表达（用真核系统） *疏水性：疏水性强的难表达（截短表达、用真核系统） 2)生物学特性：膜蛋白难表达（截短表达、用真核系统）;3)用途 药用：安全性、产量、成本（包涵体、独立表达） 工业用：产量、成本（包涵体、独立表达） 研究用：迅速获得活性产品为首要考虑（可溶、融合表达）;2、选择表达载体与宿主菌株： 1）表达载体选择 启动子、标签、标记基因、拷贝数等。 需要可溶表达时采用弱启动子，T7启动子最强，PL/PR热激诱导不宜工业化。 从蛋白特性、用途、发酵和分离纯化工艺考虑标签。 药用避免氨苄青霉素，用卡拉霉素。 4）宿主菌：符合表达要求（T7 RNA酶溶源？可溶？稀有密码tRNA？），来源与遗传背景清楚，资料翔实。;3、目的基因获得、分析与优化 克隆、合成、索要？ ;4、表达载体构建与分析 1）根据选定载体物理图和基因特点设计与构建 PCR扩增目的基因： *引物中引入适当的酶切位点，避免基因内部位点。 *是否需要目的基因带入ATG和TAA？是否要对框？ 2）表达载体酶切分析：双酶切、多酶切图谱分析 3）目的基因序列分析：目的基因或表达盒序列分析; pET21a质粒物理图谱;pET21a质粒多克隆位点与表达盒; pET32a质粒物理图谱;pET32a质粒多克隆位点与表达盒;; M 1 2 3 4 ; 5、转化与表达筛选 1）转化选定的工程菌宿主株（不同于克隆宿主菌！） 2）表达筛选：以表达水平（%）为指标。 表达水平（%）=目的产物占总蛋白的百 分数 测定方法：SDS+凝胶扫描分析 ;6、表达产物确证 1）基本要求：SDS+ Western-Blot 2）特殊要求（如基因工程药物）： A、结构：末端顺序（N-端15个/C端3个）、氨基 酸组成、肽图等 B、理化特性：分子量（SDS、质谱）、等电点、 紫外特征吸收峰等 C、生物学活性;基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制;工程菌遗传不稳定性的表现形式;重组质粒的逃逸：;关闭质粒DNA合成途径，启动降解程序;重组质粒结构不稳定性的产生原因;改善基因工程菌不稳定性的策略;改善基因工程菌不稳定性的策略;改善基因工程菌不稳定性的策略; 在非选择条件下连续传代数代后，对工程菌重组质粒存在状况、结构完整性和功能完整性进行分析： A、存在状况：宏观逃逸率 B、结构完整性：酶切图谱分析、序列分析 C、功能完整性： 表达产物免疫特异性（western blotting) 表达水平（%）;1、原始菌种保存： 实验室构建而来。冻干、-70℃保存。表达载体（质粒）和宿主菌分别冻存更稳定。 2、主细胞库（master cell bank,MCB）： 由原始菌种单一克隆一次培养与分装而来，供工作细胞库制备。 冻干、-70℃保存。 3、工作细胞库（working cell bank, WCB）: 由主细胞库单个最小包装甘油种培养与分装而来，供生产用。甘油种，-70℃保存。; 工程菌生长与表达主要影响因素 工程菌摇瓶水平生长与表达试验 工程菌工业发酵工艺研究;1、培养基 2、菌龄与接种量 3、pH值、温度与溶解氧 4、诱导时机与收菌时机;工程菌生长曲线与表达曲线分析; 1、培养基 影响菌体生长、质粒稳定性、表达水平、产物可溶性等 碳源：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等 应避免外源基因表达的“葡萄糖效应”。 氮源： 有机氮：酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米浆 无机氮： 氨水、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵等 其他：无机盐、微量元素维生素、生物素等;2、菌龄与接种量 菌龄：自接种起培养的时间（小时） 影响停滞期、质粒宏观逃逸率 接种量：是指接入的种子液体积占培养液体积的百分比 接种量过小：延长菌体停滞期，质粒宏观逃逸率高 接种量