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2011基因工程实验 食品学院 康林芝 实验一：碱裂解法抽提 质粒DNA 一、实验目的 学习并掌握基因工程操作技术中最常用的载体质粒DNA的提取方法。 二、实验原理 碱裂解法主要利用共价闭合环状质粒和线性染色质在拓扑学上的差异。 NaOH和SDS溶液使细胞裂解，在碱性溶液中，线性的大分子量细菌染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构遭破坏而发生变性，但由于质粒DNA分子量相对较小，且呈环状超螺旋结构，即使在高碱性pH条件下，两条互补链也不会充分分离。 当加入中性缓冲液调和时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不能复性，它们之间交联形成不溶性网状结构，并与细胞碎片、蛋白质、SDS等结合沉淀下来。 通过离心沉淀，细胞碎片、染色体DNA及大部分蛋白质等可被除去，而质粒DNA及小分子量的RNA则留在上清液中。混杂的RNA可用RNaseA消除。再用酚／氯仿处理，可除残留蛋白质 三、材料、试剂及仪器 1 材料： （1）菌种E.coliDH 10B含质粒pSK （2）菌种E.coliDH 10B含质粒pMP3 2 试剂: LB培养基（ 固体和液体）;氨苄青霉素(Amp,100mg/ml);20﹪SDS;溶液Ⅰ; 溶液Ⅱ（最好现配现用）;溶液Ⅲ（-20℃预冷）; 4N NaOH; 3MNaAc（PH5.2）;无水乙醇; TE缓冲液（PH8.0）; RNaseA(10mg/ml); 70﹪乙醇;饱和酚/氯仿/异戊醇（25：24：1） 3 仪器及设备 高压灭菌锅、超净工作台、恒温摇床、台式离心机、漩涡振荡器 培养用试管、量筒、冰盒、微量离心管、微量取液器、吸管头若干 四、实验步骤 1.细菌的培养 （1）配制LB液体和琼脂培养基，并高压灭菌 （2）当培养基不烫手时把Amp加入琼脂培养基中倒平板使终浓度为Amp100μg/ml （3）在Amp100μg/ml的琼脂培养基平板上用接种环划线分别培养出含mp3和psk质粒的大肠杆菌的单菌落（37℃.18-20个小时） （4）取2支灭菌的12mL培养管，加入2.5mL液体LB培养基和2.5μLAmp母液（1000x） （5）用灭菌的镊子夹一个灭菌的牙签，在单菌落上沾一下放入液体培养基中 （6）盖上盖子，将培养管倾斜插在摇床上，37℃过夜培养（ 200rpm，14-16小时，一般不超过18小时）。 2 质粒DNA的提取 取1.5 ml菌液入1.5ml的离心管中 ? 5000rpm、离心2min，弃上清，收集菌体（如果想提取多一点DNA，再吸取1.5ml菌液到同一离心管中，离心，弃上清）:离心时离心管方向要固定，柄朝外，方便看是否离下来 ? 用移液枪尽可能除去上清液，然后150uL溶液I悬浮菌体 用涡旋振荡器充分振荡 ：溶液I最好要放冰上 ? 加入250uL溶液II，缓慢上下翻转离心管10多下，温和混匀，冰上静置5min ：充分裂解菌体 ? 加入180uL预冷的溶液III，上下翻转十多下，温和混匀，冰上静置10min或者放入-20℃冰箱5min : 使染色体DNA等沉淀，而质粒DNA复性 ? 12000rpm，4℃离心5min。 ? 取上清。加2/3体积的酚/氯仿12000rpm，混匀。12000rmp离心5min ：用于抽提脂类，蛋白质等。 在混匀时，要盖紧盖子，用纸巾包住离心管，来回翻转。离心后会发现溶液分三层，上层为含DNA，RNA的水相，中间为蛋白质，下层为有机相 ? 移取上清液，加2倍体积的无水乙醇（大量提取时可以用0.6倍的异丙醇代替），混匀：用于沉淀DNA， ? 12000rpm离心5min，倒掉酒精。离心几秒钟，用移液枪尽可能除去酒精。用0.5ml 70%酒精洗DNA一次，离心2min，倒掉酒精 70%酒精可以使DNA保持不溶解的状态，30%的水还可以使离子洗去 ? 离心几秒，用移液枪尽可能除去酒精，风干十分钟 此时DNA变成无色透明 ? 加入50ulTE（含50ug/mgRNaseA）溶解DNA沉淀。放置金属浴65℃加热10min或37℃放置数小时 使RNaseA发挥作用，并且DNA酶在此条件下会失活 ? -20℃保存备用 3 质粒DNA的进一步纯化 加入TE使DNA溶液为200ul，加入等体积的酚/氯仿，充分振荡：会分