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纳洛酮对海马神经元的预防保护作用 The protectiveeffects of nalaxone in anoxic cultured natal hippocampal neuronal cells QI Hua,QI Yan,LU Song.Qingdao Cancer Hospital，Qindao *****,China Nalaxone；Anoxic；Hippocampal neuronal cells；Antioxidants 脑缺血时机体产生大量的氧自由基，且NO在体内局部浓度升高，与周围的氧自由基等反应而生成活性氮氧化合物，是一种强氧化剂，也可启动脂质过氧化。自由基医学的研究表明，神经元的损伤、凋亡、坏死等与脂质过氧化密切相关，而抗氧化剂可通过清除自由基，提高抗氧化酶等途径有效的阻断或防止这一过程sup［1］/sup。近年发现纳络酮还具有非拮抗阿片受体作用，对稳定脑出血后神经元有一定的作用，但目前还缺乏对海马神经元培养的相关实验支持sup［2］/sup。本试验体外培养海马神经元，建立急性气体缺氧模型，胎盘兰染色细胞计数并做流式细胞仪检测以及酶法测定抗氧化酶（超氧化物歧化酶）的抗氧化能力及丙二醛、NO的含量。以此来探讨纳络酮在体外是否有抗缺氧损伤的作用，其作用机制是否是通过抑制细胞凋亡，提高抗氧化酶的活力，清除自由基，而发挥作用的。从而来确定纳络酮在脑缺血中的神经元保护作用，并寻求预防和治疗脑缺血发生的药物。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物为新生的Wister大鼠，由青岛大学实验中心提供。 1.1.2 试剂 尼莫地平（德国拜耳公司），DMEM、马血清（Gibco公司），胎牛血清（杭州西季青生物材料工程公司），超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MAD）、一氧化氮（NO）（南京建成生物工程研究所），多聚赖氨酸（Sigma公司）。 1.1.3 主要仪器设备 *****，BX50，PM-20系统显微镜（日本），PM-6，*****解剖显微镜（日本），二氧化碳细胞培养箱（上海福玛实验设备有限公司），YJ超净工作台（垂直单向流型）（苏州市洁净技术研究所）。 1.2 方法 1.2.1 海马神经元的培养 按已有的细胞培养方法sup［3］/sup，取新生1~3 d的Wister大鼠，消毒，断头，分离出双侧海马，剪碎成1 cm×1 cm×1 cm的组织块，加入1.25 g/L胰酶消化30 min（中间轻轻振荡几次），用含有10%胎牛血清及10%马血清的种植培养液终止胰酶的作用。制成细胞悬液（1.0×106 /ml）接种到六孔板中（2 ml /孔），37℃5%COsub2/sub培养箱中培养24 h后更换维持培养液（5%胎牛血清、10%马血清），以后每3 d半量换液一次，第4~5天加入阿糖胞苷，终浓度为5 mg/L。接种10~14 d的海马神经元用于本实验。 1.2.2 尼氏染色鉴定神经元 将培养的海马神经元经0.02 mol /L PBS（pH7.4）漂洗1~2次，4%中性福尔马林溶液固定1 h，PBS漂洗后，1%甲苯胺蓝染液中染色20 min，95%乙醇分色，37℃干燥，二甲苯透明，中性树脂封片。 1.2.3 分组及给药 接种10~14 d的海马神经元分为4组：对照组；尼莫地平5 umol/L组；加入5%、10%纳洛酮组。每组4个六孔板，将所用药物加入到细胞培养液中进行孵育。 1.2.4 缺氧模型的制备sup［4］/sup 4 h后将已分组给药的培养板移入37℃恒温密闭容器中，连续充以95%NOsub2/sub+5%COsub2/sub混合气体，流速为20 ml/min，持续1 h。 1.2.5 海马神经元细胞凋亡率的检测 将上述处理过的细胞制成单细胞悬液，1000转/min离心10 min，摒上清，PBS冲洗，70%乙醇固定，400目的筛网过滤，加PI染液，上流式细胞仪检测。 1.2.6 海马神经元上清液中SOD、MDA、NO的测定 按试剂盒说明书的要求先求出样本的最佳加样量；海马神经元经上述同样处理后，取细胞上清液，按试剂盒说明书的要求操作，测定各样本的吸光度，并依下列公式计算出SOD，MDA，NO的含量。 SOD 活力（U /ml）=（对照管吸光度－测定管吸光度）/对照管吸光度÷50%×反映体系的稀释倍数×样本测试前的稀释倍数。 MDA 含量（nmol /ml）=（测试管吸光度－测定空白管吸光度）/（标准管吸光度－标准空白管吸光度）×标准品浓度（10 nmol /ml）×样本测试前稀释倍数。 NO含量（umol /L）=