科教生物化学蛋白质6.ppt

Denaturation( 变性) 定义: 蛋白质的特定空间构象被破坏,从而导致其理化性质改变和生物活性丧失,称蛋白质变性. 变性蛋白质理化性质： （1）溶解度降低 （2）粘度增加，结晶能力消失 （3）生物活性丧失 （4）容易被蛋白酶水解 牛 胰 核 糖 核 酸 酶 分 子 的 变 性 与 复 性 变性：蛋白质在一些理化因素的作用下，其正常的空间构象遭到破坏，主要是次级键或二硫键发生破坏，导致蛋白质的理化性质的改变（如溶解度下降、粘度增加）和生物学活性的丧失。蛋白质的变性不影响其一级结构。 变性 物理因素：加热、紫外线照射、超声、剧烈震荡等 化学因素：强酸、强碱、有机溶剂、重金属盐等 沉淀 改变pH至pI 破坏水溶液中蛋白质 的水化膜和中和电荷 （变性蛋白质） （蛋白质未变性） 凝固 加热 （变性，不再溶解） 变性不一定沉淀 沉淀不一定变性 凝固均变性并不溶解 加热 酚试剂呈色反应（Lowry test）：除蛋白质分子 中肽键与碱性Cu2+发生二缩脲反应外，蛋 白质分子中的色氨酸与酪氨酸残基还将试 剂中的磷钨酸和磷钼酸盐还原生成蓝色化 合物（钼蓝） 蛋白质的理化性质与常用的纯化方法 理化性质 相应的分离纯化方法 分子大小和形态 差速离心、超滤、分子筛、透析 溶解度 盐析、萃取、分配层析、结晶 电荷差异 电泳、等电聚焦电泳、离子交换层析 生物功能专一性 亲和层析 A：根据蛋白质分子大小分离纯化蛋白质 透 析 超滤（ultrafiltration）: 在一定的压力下，使蛋白质溶液在通过一定孔径的 超滤膜时，小分子量物质滤过，而大分子量的蛋白质被 截留，从而达到分离纯化的目的。这种方法既可以纯化 蛋白质，又可达到浓缩蛋白质溶液的目的。 磁力搅拌器 待超滤的蛋白质溶液 加压的氮气 超滤膜 盐析： 高浓度中性盐使蛋白质从溶液中析出 有机溶剂沉淀： 降低溶液的介电常数，使蛋白质分子间 相互吸引而沉淀；有机溶剂与水作用，不 断压缩大分子表面水层，使相互凝结析出 B：改变蛋白质溶解度分离蛋白质 有机溶剂沉淀： 降低溶液的介电常数，使蛋白质分子间 相互吸引而沉淀；有机溶剂与水作用，不 断压缩大分子表面水层，使相互凝结析出 根据各种蛋白质在一定的pH环境下所带电荷种类 与数量不同的特点，将不同蛋白质予以分离。 　　常用的方法有： 　　电泳 离子交换层析 　　等电聚焦 C：根据蛋白质电荷性质的分离方法 电 泳：带电物质在外加电场作用下 向相反电极移动的现象 原点 带负电荷蛋白质的泳动方向 滤纸、醋酸纤维素 薄膜或其他支持物 阳极 阴极 电极缓冲液 电极缓冲液 电泳示意图 电泳（electrophoresis）： 等电聚焦（isoelectric focusing,IEF）: 在具有pH梯度的电场中进行的电泳。每种蛋白质均有其特定的等电点，在pH呈梯度的电场中，按其等电点不同，带有不同的电荷，于是向与其带电相反的电极方向泳动。这样，在电泳时某一蛋白质迁移到电场中某一处的pH等于其等电点时，该蛋白质便因不带电荷而停止泳动。这样，各种蛋白质按其等电点不同得以分离。 + (H2SO4) (NaOH) pH3 pH10 + (H2SO4) (NaOH) pI 4.5 5.1 6.0 7.9 8.1 pH3 pH10 将第一相胶条 加到第二相电 泳中，走向与 第一相垂直 等电聚焦 ( IEF ) pH3.0 pH10.0 第一相IEF 按pI进行分离 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS） 电泳走向 第二相SDS按分子大小分离 pH3.0 pH10.0 ? + ? + 双向电泳（two dimensional electrophoresis）： * 二、肌红蛋白和血红蛋白的空间结构与功能的关系 （一）肌红蛋白的空间结构与功能的关系 肌红蛋白（myoglobin, Mb）是由153个氨基酸残 基