PEG沉淀法-病毒提纯方法.docxVIP

Vinises such as baculovirus can be concentrated by polyethylene glycol precipitation. Adjust the pH of the vims-containing supernatant to 7.2-7.5. Polyethylene glycol (PEG, MW 6.000) is added to a final concentration of 8% (w/v). Stir at 4°C for 2 hours. Centrifuge at 10.000 x g for 2 hours. Resuspend the pellet in a small volume of appropriate buffer ( c.g?，RNase-free ddH2 for virus RNA prep). 沉淀法-病毒提纯方法 主要是从稀的悬浮液中浓缩病毒，有中性盐沉淀法、聚乙二醇（PEG）沉淀法、有机溶剂沉淀 法、等电点沉淀法、皂 土法和鱼精蛋白沉淀法等。 中性盐沉淀法：病毒一般在45%以上饱和度的硫酸钱溶液中沉淀.且保持其感染性。在含有病毒的组织培养液 中加入等体积的饱和硫酸钱，可以很容易地沉淀某些病毒如狂犬病毒、鸡新城疫病毒等。 2?聚乙二醇沉淀法：聚乙二醇（PEG）为水溶性非离子型聚合物，具有各种不同的分子量，用于病毒沉淀的主要是 分子量为2 000-6000的PEG。将PEG配成50%左右的溶液，或直接将固体PEG加于病毒悬液中，使其达到所需浓 度，通常在4C搅拌过夜，然后离心使病毒沉淀。Tanncock（1985年）成功地用PEG浓缩了禽脑脊髓炎病毒。 3?有机溶剂沉淀法：甲醇、氯仿、正丁醇、氟碳化合物等都可用于提纯病毒，但乙讎、氯仿等脂溶剂对于具有脂质 饗膜的病毒具有破坏和火活作用，故不适于这类病毒的浓缩提纯。 4?等电点沉淀法：病毒粒子在等电点时，所携带的正电荷与负电荷相互中和，因而失去相互排斥的作用而发生沉 淀。多数病毒的等电点在pH4?5?5?5之间，因此在pH3?6范国内均可沉淀，由于一部分细胞成份在等电点时亦发 生沉淀.此法效果不太理想，但从感染的组织培养液中浓缩病毒，可以获得较好结果。应用酸性范帀的等电点沉淀 或分级沉淀病毒时，必须注意pH对病毒活性的影响及病毒粒子电荷与组织蛋白电荷的差异。 5?皂上法：Girin（1989年）应用皂土在酸性条件下（pH4?4?5）吸附轮状病毒SA-11,再在碱性条 件下（pH8.5）, 又使其洗脱下来，从而达到纯化目的。 6?鱼精蛋白沉淀法：鱼精蛋白为碱性蛋白，具有携带其它蛋白质共沉淀的作用，能和直径大于50nm的病毒共 同沉淀而不影响病毒的感染力。当向这种沉淀物加入lmol/LNaCl时，病毒又重新释放到悬液中，而鱼精蛋白仍然 沉淀。直径小于50nm的小型病毒则不与鱼精蛋白共同沉淀。因此，可利用鱼精蛋白去除病毒材料中直径大于50nm 的异种蛋白质。 聚乙二醇H0CH2（CH20CH2）nCH20H（n4） （ Polyethylene Glycol简写为PEG）,它的亲水性强，溶于水和许多有机 溶剂，对热稳左，有广泛国的分子量，在生物大分子制备中，用的较多的是分子量为6000?20000的PEG。 PEG的沉淀效果主要与苴本身的浓度和分子量有关，同时还受离子强度、溶液pH和温度等因素的影响。在一泄的 pH值下，盐浓度越髙，所需PEG的浓度越低，溶液的pH越接近目的物的等电点，沉淀所需PEG的浓度越低。在 一泄范围内，髙分子量和高浓度的PEG沉淀的效率髙。以上这些现彖的理论解释还都仅仅是假设.未得到充分的证 实，其解释主要有：①认为沉淀作用是聚合物与生物大分子发生共沉淀作用。②由于聚合物有较强的亲水性，使生 物大分子脱水而发生沉淀。③聚合物与生物大分子之间以氢键相互作用形成复合物，在重力作用下形成沉淀析出。 ④通过空间位宜排斥，使液体中生物大分子被迫挤聚在一起而发生沉淀。 有机聚合物沉淀的优点是：①操作条件温和，不易引起生物大分子变性：②沉淀效能髙，使用很少量的PEG即可以 沉淀相当多的生物大分子：③沉淀后有机聚合物容易去除。 水溶性非离子型聚合物沉淀法常用的聚合物为聚乙二醇（PEG）及硫酸痢聚糖。水溶性聚合物沉淀蛋白质的机制尚 不淸楚，大致有如下解释：①聚合物与蛋白质形成共沉物；①聚合物与蛋白质之间发生水的重分配：①聚合物与蛋 白质形成复合物。此法受许多因素影响，主要是pH、离子强度、蛋白质浓度和PEG的分子量等。分子量为2000? 6000的PEG皆适宜于做蛋白沉淀用。如若使用得当，效果甚为满意。一般认为，PEG浓度在3%?4%时沉淀免疫复 合物，6%?7%可沉淀IgM, 8%?12