产反式—4—羟脯氨酸重组大肠杆菌的构建及优化.docxVIP

产反式—4—羟脯氨酸重组大肠杆菌的构建及优化 [ZK）] 羟基脯氨酸（Hyp）是一种手性亚氨基酸，被广泛应用于医疗保健、美容、化工、畜牧等领域。最初人们通过水解哺乳动物的胶原蛋白来获取反式-4-羟脯氨酸，但此法有许多弊端。 1999年，研究人员筛选得到指孢囊菌RH1，从该菌中提取到能高效表达的反式-4-脯氨酸羟化酶，并获得反式-4-脯氨酸羟化酶基因序列，之后该研究团队又将获得的基因序列和脯氨酸代谢过程中的关键酶基因成功导入大肠杆菌质粒中获得重组工程菌，在以葡萄糖为碳源的发酵体系中，发酵4 d后可得25 g/L的反式-4-羟脯氨酸，大大提高了反式-4-羟脯氨酸的发酵效率[4-6]。日本协和发酵生物技术公司也确立了反式-4-羟脯氨酸的高效微生物发酵生产法。 但该技术在国内仍有待优化。本研究为构建1株能够高效表达反式-4-脯氨酸羟化酶基因的重組大肠杆菌，尝试优化反式-4-脯氨酸羟化酶的编码区基因序列，并通过添加g10-L翻译增强子、SD序列、优化mRNA起始区二级结构、简化色氨酸启动子等方式进行试验，最后对质粒载体和宿主菌的选择进行优化，以获得发酵过程中比酶活最高的重组菌。 1材料与方法 1.1菌株和质粒 本研究所采用的菌株和质粒见表1。 1.2反式-4-脯氨酸羟化酶比酶活的测定 将标准反式-4-羟脯氨酸溶液稀释25倍得浓度为 4 mg/L 的标准溶液，测定其D560 nm，对重组大肠杆菌的发酵液进行预处理后，测定发酵液的D560 nm、D600 nm，绘制反式-4-羟脯氨酸标准曲线，根据公式（1）计算重组菌细胞干质量。 [JZ（]DWC=0.54×D600 nm。[JZ）][JY]（1） DCW单位为g/L。 发酵液12 000 r/min离心2 min，弃上清，回收菌体，将 500 μL 的酶反应缓冲液（MES 240 mmol/L，pH值6.5，脯氨酸20 mmol/L，2-酮戊二酸40 mmol/L，硫酸亚铁4 mmol/L，维生素C 8 mmol/L）加入到菌体中，将细胞重新悬浮，于 35 ℃ 摇床220 r/min培养15 min，转移到100 ℃水浴中加热2 min，采用氯胺T法测定反式-4-羟脯氨酸的浓度。 1个酶活性单位为1 min将1 nmol脯氨酸完全转化为反式-4-羟脯氨酸的酶量，单位为U；比酶活是1 mg干菌体的酶活性，单位为U/mg，推出计算公式（2）。 [JZ（]比酶活=0.094×D560 nm/D600 nm。[JZ）][JY]（2） 式中：D560 nm为反应体系在560 nm波长处的吸光度。 1.3反式-4-脯氨酸羟化酶基因优化 来源于指囊孢菌RH1的反式-脯氨酸-4-羟化酶基因序列共819 bp，编码272个氨基酸，RH1与优化模板E.coli K12对比，最适密码子所占比例差异较大，根据密码子优化策略，使用JCAT软件优化密码子，排除出现终止子、限制性内切酶酶切位点和RBS序列的可能，将RH1序列中稀有密码子替换为最适密码子。根据N-端规则，将亮氨酸（Leu）突变为缬氨酸（Val），避免序列对应编码的第2个氨基酸残基为Leu，增长蛋白质半衰期。 1.4非编码区优化 1.4.1g10-L翻译增强序列 来源于T7噬菌体的g10-L翻译增强序列由9个碱基组成（*****UA），其对外源基因的表达量有显著的增强作用，可达40～340倍，已知pET28a的一段RBS区如图1所示，其内部已包含了g10-L翻译增强序列。 [CM（26]1.4.2SD序列SD序列通常由4～5个核苷酸组成，在原[CM）] [FK（W3][*****.tif][FK）] 核生物核糖体与mRNA结合的时候，SD序列能帮助mRNA从起始处开始翻译[10-11]，有研究表明，在测试中将SD序列与E.coli K12的基因组用SPSS软件做CAI值和离散增量相关分析，以AAGGA为核心的SD序列为强SD序列。图2中下划线为SD序列，阴影区域为SD序列的强核心，在SD序列前端的9个核苷酸则是T7 g10-L翻译增强序列。有报道称，将T7 g10-L序列置于表达质粒的SD序列上游能有力地提高下游基因编码蛋白的表达水平。 [FK（W3][*****.tif][FK）] 1.4.3mRNA翻译起始区二级结构优化 mRNA翻译起始区（translation initiation region，TIR）由起始密码子AUG前后数十个碱基组成，TIR中任何1个碱基的改变都有可能对其二级结构产生巨大影响，从而改变mRNA翻译过程中的起始效率[14-