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临床微生物学检验技术 一、微生物的分类：原核细胞型、真核细胞型、非细胞型微生物。 二、原核细胞型微生物 1.特点：（1）只有原始核物质（DNA）；（2）不具有膜界定的细胞核，也无核仁；③遗传物质为环状裸露的双股DNA。 2.例子：细菌、支原体、衣原体、立克次体、螺旋体和放线菌。 三、真核细胞型微生物 1.特点：（1）细胞核分化程度高；（2）有核膜和核仁，通过有丝分裂进行繁殖；（3）胞浆内有多种完整的细胞器。 2.例子：真菌、海藻。 四、非细胞型微生物 1.特点：无产生能量的酶系统，只能在活细胞内生长繁殖。 2.例子：病毒。 第一章 一、不染色标本的检查 1.检测：不染色标本一般用于观察细菌的动力及运动情况，但不能清楚地看到细菌的形态及结构特征。有动力的细菌在镜下呈活泼有方向性的运动，有明显位移；无动力的细菌则在原位颤动，呈不规则的布朗运动。常用的方法有压滴法和悬滴法，以普通光学显微镜观察，日用暗视野显微镜，效果更好。 2.初步鉴定：在临床上，有时通过不染色标本的动力检查可对某些病原菌作出初步鉴定。如疑似霍乱患者，可取米泔样便，制成压滴或悬滴标本，高倍镜或暗视野下观察细菌动力，若见穿梭样运动的细菌，则同法再制备一标本片并加入O1群霍乱弧菌抗血清，若细菌的活跃运动现象消失，称之为制动试验阳性，可初步推断为“疑似O1群霍乱弧菌”。另外螺旋体由于不易着色并有特征性的形态特点，亦可用不染色标本作暗视野显微镜观察。 二、穿刺接种法 1.用于半固体培养基或双糖铁、明胶等具有高层的培养基接种，以保存菌种或观察细菌的动力和生化反应。 2.方法：用接种针挑取细菌纯培养物，于半固体培养基的中心处向下垂直穿刺接种，直至试管底部上方5mm左右（不能穿至试管底），接种后的接种针沿原穿刺线退出;或在双糖铁琼脂斜面中心穿刺，沿原路退出，并用接种针在斜面划曲线。 三、氧化酶试验 （1）原理:氧化酶也称细胞色素氧化酶，是细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶。具有氧化酶的细菌首先氧化细胞色素C，然后氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化， 生成有颜色的醌类化合物。 使用盐酸甲基对苯一胺时， 产物早紫红色:使用盐酸四甲基对苯二肢时，产物呈蓝色。 （2）试剂: 1%盐酸二甲基对苯二胺或1%盐酸四甲基对苯二胺。 （3）应用:主要用于肠杆菌科和非发酵菌的鉴定，前者名为阴性，弧菌科、非发酵菌多。为阳性。此外奈瑟菌属、莫拉菌属也星阳性。 四、过氧化氢酶（触酶）试验 （1）原理:有些细菌具有过氧化氢酶，可把过氧化氢分解成水和新生态氧，进而形成分。子氧出现气泡。 （2）试剂: 3%过氧化氢溶液。 （3）应用:主要用于革兰阳性球菌的初步鉴定。葡萄球菌属和微球菌属触酶试验阻性，链球菌属触酶试验阴性。金氏杆菌属细菌的触酶试验也阴性。 五、凝固酶试验 （1）原理:葡萄球菌可产生两种凝固酶。一是结合在细胞壁上的结合凝固酶，使血浆中的纤维蛋白原变成纤维蛋白而附着于细菌表面，发生凝集，玻片法可检测结合凝固酶。另一种是分泌至菌体外的游离凝固酶，类似凝血酶原物质，可被血浆中的协同因子激活变成凝血酶样物质，使纤维蛋白原变为纤维蛋白。从而导致血浆凝固，游离凝固酶可用试管法检出。 （2）试剂:免血浆。 （3）应用:作为鉴定葡萄球菌致病性的重要指标。金黄色葡萄球菌产生凝固酶，使血浆凝固。而表皮及腐生葡萄球菌的凝固酶则阴性。 六、克氏双糖铁或三糖铁琼脂培养基试验 （1）原理:双糖铁（或三糖铁）培养基是以酚红做指示剂，含有葡萄糖和乳糖（蔗糖），其中葡萄糖含量仅为乳糖（蔗糖）十分之的固体培养基。 能发酵乳糖（和蔗糖）或同时发酵葡萄糖的细菌产酸量较大，使KIA（或TSI）的斜面和底层均呈黄色；只能发酵葡萄糖，面不发酵乳糖（和蔗糖）的细菌，产酸量较少，在最初培养的8 ~10小时也可使深层和斜面均呈黄色，连续培养18~ 24小时后，斜面部分的酸由于挥发、氧化和被细菌降解氨基酸所产生的胺类中和，斜面部分又恢复红色。底层由于处于缺氧状态，细菌分解氨基酸产生的酸一时不被氧化，依然呈黄色；如果发酵糖类产生气体，可在培养基中出现气泡或气体冲破琼脂的裂隙；有些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸，产生的H2S在酸性条件下遇铅或铁离子形成硫化铅或硫化亚铁，在底层形成黑色的沉淀物。 （2）培养基: KIA或TSI琼脂培养基。 （3）应用:主要用于肠杆菌科细菌的初步鉴定。 第二章 一、真菌的检验方法包括：标本直接镜检、染色镜检、分离培养、生化反应及免疫学试验等。 二、直接镜检处理标本所用溶液 1.KOH溶液：由于KOH溶液可促进角质蛋白的溶解，所以本液适于致密、不透明标本的检查，如毛发、指甲及鳞屑等。根据标本的质地不同，可选用不同的浓度，如皮屑可用10%，毛发可用20%，必要时可在10%的KOH溶液中加入终浓度为40%的二甲基亚砜，以进一步促进角质的溶