实验四限制性内切酶分析1.pptVIP

实验十八 DNA的电泳及限制性内切酶分析 实验原理 Hin d III 是应用最广泛的限制性内切酶之一，酶切位点和切割位点如下：　 DNA采用PCR法获得内参基因GAPDH（815bp） 。 GAPDH片段中含有一个Hin d III酶切位点，酶切之后为215bp和600bp两条DNA片段。 实验步骤 StepⅠ 使用1.5ml Eppendorf（EP）tubes 按下表配置酶切体系，混匀 StepⅦ 染色、观察： 荧光染料如溴化乙锭(EB)，EB为扁平分子，很易插入DNA中的碱基对之间。DNA与EB结合后，紫外光照射时可发射出橙红色可见荧光。 凝胶自动处理系统（UVP）观察和拍照，记录结果。 注意事项 微量操作注意精确性 电泳上样时要小心操作，防止样品溢出。 接触含有EB的凝胶时，要戴手套，废物丢弃要在固定位置。不接触凝胶时不需戴手套！ EB是极强致癌物！小心！ 临床意义 限制性核酸内切酶谱分析，用于基因诊断。 * 定义：识别双链DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割 双链DNA的一类核酸内切酶。 限制性内切酶 阿尔伯，内森斯和史密斯 三人共同获得了1978年诺 贝尔生理学或医学奖。 Restriction Endonuclease GGATCC CCTAGG G CCTAG GATCC G + Bam HⅠ 分类： Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类 命名： 第一个字母取自产生该酶的细胞属名，用大写； 第二、第三个字母是该细胞的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。 Hin dⅢ 属 系 株 序 Haemophilus influenzae d strain Ⅲ 流感嗜血杆菌d株的第三种酶 识别和切割位点 回文结构(Palindrome) GGATCC CCTAGG 产生黏性末端（sticky end）或平头末端（blunt end） Marker 1 2 2000bp 1000bp 750bp 500bp 750bp 500bp 250bp 100bp 215 bp 600 bp 815 bp Marker：DL2000 1：酶切标本 2：PCR产物（未酶切） 20 μl 2.5 μl 10 μl 2.5 μl 5 μl Hin d III DNA（PCR产物） 10×buffer ddH2O 漩涡离心机瞬时离心。 StepⅡ 37℃保温1h。 StepⅢ 1.0%琼脂糖凝胶制备： 使用微波炉（ 中高火）加热agarose（1~2min） ，待溶液冷却至60℃； 将琼脂糖溶液倒入胶模中，厚度约3-5mm，避 免产生气泡； StepⅣ 酶切结束后，加入4 μl 6×loading buffer， 混匀备用。 凝胶完全凝固后，移去梳子，将凝胶放入电泳槽， 点样端置于负极。TAE缓冲液使恰好没胶面约1mm。 StepⅤ 20μl Loading ： M 未酶切 DNA 酶切样品 - + StepⅥ 电泳： 120V ，30- 40 min