免疫细胞化学多媒体.pptxVIP

第六章 免疫细胞化学技术（免疫组化） ( immunocytochemistry ) 是利用免疫反应来定位组织和 细胞中特异大分子的一类技术 免疫细胞化学技术 第一节 免疫细胞化学原理 ★ 第二节 免疫细胞化学方法 第一节 免疫细胞化学原理 一、免疫反应的特异性 二、免疫细胞化学反应 三、抗原 四、抗体 五、标记物及其在光镜和电镜下可见性 一、免疫反应的特异性 免疫反应的特异性表现在： 抗原作为一类结构复杂的大分子能刺激机体 产生对其特异的抗体并与抗体发生反应 抗体针对某种抗原分子而产生的，特异地识 别该抗原并与其结合 二、免疫细胞化学反应 免疫细胞化学反应的原理： 把组织细胞中的特异分 子作为抗原,用在显微镜下可 见的标记物标记特异抗体(或 者标记抗原抗体复合物)使特 异的免疫化学反应具有可见 性,从而间接地显示抗原,达 到在细胞或细胞器水平定位 特异分子的目的组织抗原抗体标记物标记抗体1 荧光2 酶3 亲和技术4 金标 免疫细胞化学反应过程为：标记物抗原＋ 两种免疫反应方法 直接法间接法 三、抗原 抗 原： 凡能刺激机体产生抗体并能与 抗体特异结合的物质称为抗原 抗原性： 物质所具有的这种特性称为抗原性 细胞中具有抗原性的化学成分有： 蛋白质 多肽 脂蛋白 多糖 脂多糖 糖蛋白 核蛋白 这些生物大分子都能用免疫细胞化学技术检测吗? 从生物学功能来看都包括了哪些物质?具有抗原性的物质包括： 酶、 受体、 抗体、 细胞外基质 激素、 细胞结构蛋白、病原体等 FabFcNNCCCCNN 四、抗体 抗体的结构Fab片段 具有抗体活性，决定某种抗体 与抗原结合的能力和特异性Fc片段 决定该抗体本身作为抗原刺激 机体产生抗体的能力和特异性 决定其本身抗原性 免疫细胞化学技术中所用的抗体有两种： 抗 血 清 — 多克隆抗体，是用提纯的抗原 免疫动物后从动物血清制备得 到的 单克隆抗体 — 是指由单个产生特异抗体的 Ｂ淋巴细胞分化增殖形成的 细胞克隆产生的抗体 五、标记物及其在光镜和电镜下的可见性 1 免疫荧光技术 2 免疫酶技术 3 免疫亲和技术 4 胶体金技术 标记物 使抗体或抗原 抗体复合物在 各种显微镜下 可的物质 免疫荧光技术将 荧光素作为标记物 使组织细胞中形成的抗原抗体复合 物在荧光显微镜下可见，从而显示 抗原物质的定位 （一） 免疫荧光技术 荧光素 能产生荧光并能作为染料的一类化合物 １.异硫氰酸荧光素 ２.四乙基罗达明 ３.四甲基异硫氰酸罗达明 ４.藻红蛋白 ▲ 分子量不同▲ 最大吸收光谱不同 ▲ 最大发射光谱不同 ▲ 与蛋白结合方式不同 ▲ 呈现不同的荧光： 黄绿色荧光 橙色荧光 橙红色荧光等 荧 光： 在激发光（荧光显微镜提供）的照射下，能发出较激发光波长更长的可见光并随照射停止而消失 荧光显微镜： 荧光显微镜的光源提供各种激发光，如 紫外光、蓝紫光（有不同的波长范围） 使受检标本内的荧光物质发光（二） 免疫酶技术 是将酶作为标记物使组织细胞中形成的抗原抗体复合物得到标记，再通过酶细胞化学反应产生显微镜下可见的显色物质，间接显示抗原物质的定位 免疫酶技术优点： 1.反应产物定位准确，颜色对比清晰 2.反应后标本材料可长期保存 3.能用于电镜观察抗原一抗二抗酶酶标二抗抗酶抗体酶—抗酶抗体复合物酶标记的三种形式酶标抗体法抗酶抗体法 复合物法 酶标抗体法 用交联剂将酶与抗体联接成酶标抗体用于直接法和间接法 抗酶抗体法或称酶桥法 用酶免疫动物获得抗酶抗体，通过二抗的桥梁作用把抗酶抗体连接在一抗上,再加入酶及其底物，达到用酶标记抗原抗体反应的效果 由于产生抗酶抗体的动物与产生第一抗体的动物是同一种属，两种抗体具有相同的免疫源性，所以在反应中本来针对一抗的二抗也能与抗酶抗体结合酶－抗酶抗体复合物法 优点: 1、抗体活性高 2、灵敏度高 先获得抗酶抗体并将抗酶抗体与酶一起预先制成酶－抗酶抗体复合物 在反应中，由二抗的桥梁作用把复合物与一抗连接在一起 最后加入底物，从而达到用酶标记抗原抗体反应的效果常用的标记酶：1. 辣根过氧化物酶 2.碱性磷酸酶１.辣根过氧化物酶 （hoseradish peroxidase, HRP） 常用的两种方法是： （1）过氧化物酶标记抗体法 （2）过氧化物酶-抗过氧化物酶复合物法 （Peroxidase-Antiperoxidase,PAP） 一抗与组织抗原特异结合 二抗又将PAP复合物与第一抗体连接在一起 然后加入HRP的天然底物H2 O2 和捕捉底物DAB 光镜-棕黄色反应产物(组织抗原的定位)常用