第13章基因重组和基因工程.pptxVIP

基因工程与基因体外表达 Genetic Engineering and gene expression in vitro;重组DNA技术的发展史;1972年,P.Berg: 构建第一个DNA重组分子;一、重组DNA技术相关概念;技术水平：分子克隆(molecular clone) （即DNA 克隆） 细胞克隆 个体克隆（动物或植物）　;应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA (recombinant DNA) 。 ;生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等。;重组DNA技术基本原理;第一节 基因克隆是利用工具酶 进行操作;关键步骤一的工具： 关键步骤二的工具： 关键步骤三的工具：;工具酶;限制性核酸内切酶(restriction endonuclease) ;与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。;第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。;Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome) ;Bam HⅠ;来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。;有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatible end)。;名　　称　　 　识别序列及切割位点;重组DNA技术中常用的工具酶;第二节基因克隆需要特定的载体; 基因载体;克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。;;载体的选择标准：;质粒 (plasmid);;;; λ噬菌体DNA改造系统 λgt系列（插入型，适用cDNA克隆） EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）;;λ 替换型载体（取代型载体）;凯伦噬菌体载体 既有插入型；又有替换型 在基因工程实验中的用途十分广泛 承受外源DNA的能力：几个kb到23kb ;3. 粘性质粒(cosmid):适合克隆大的DNA片段; 柯斯质粒载体的特点 具有λ噬菌体的特性； 具有质粒载体的特性； 具有较高容量的克隆能力； 具有与同源性序列的质粒进行重组的能力;;整合型（integrated）载体：即外源基因通过这种病毒载体与宿主细胞的染色体整合，外源基因随宿主细胞基因组的复制而扩增。这类载体的代表是 SV40－PSV系列和逆转录病毒－逆转录病毒表达载体pLPGHL、pMSV 等。 游离型(transient)或称病毒颗粒型载体，这类载体携带外源基因后，本质上仍然是一种完整或缺损的病毒，能够以病毒颗的形式在宿主内自行复制或在辅助病毒存在下进行复制。这类载体有痘苗病毒、腺病毒、杆状病毒。;病毒载体;常用的病毒载体的特点：; 酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒DNA改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）;表达载体;原核表达载体;原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有： Lac(乳糖启动子)、 Trp(色氨酸启动子)、 Tac(乳糖和色氨酸的双启动子) 、 λ PL(λ 噬菌体的左向启动子)、 T7噬菌体启动子等。;真核表达载体至少要含两类序列： ①原核质粒的序列，包括在大肠杆菌中起作用的复制起始序列、能用在细菌中筛选克隆的抗药性基因标志等，以便插入真核基因后能先在很方便操作的大肠杆菌系统中筛选获得目的重组DNA克隆、并复制繁殖得到足够使用的数量。 ②在真核宿主细胞中表达重组基因所需要的元件，包括启动子、增强子、转录终止和加poly-A信号序列、mRNA剪接信号序列、能在宿主细胞中复制或增殖的序列，能用在宿主细胞中筛选的标志基因、以及供外源基因插入的单一限制性内切酶识别位点等。 ;选用质粒（最常用）做载体的4点要求： ①选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损 坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）； ②一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10 个以上的拷贝，而严谨型质粒10个。 ③必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；