何水林版基因工程第五章__基因的转移与重组体的筛选和.pptxVIP

第五章　基因的转移与重组体的　筛选和鉴定第一节 DNA的体外重组DNA的体外重组：将目的基因与载体连接，这种重新组合的DNA称为重组DNA。一、粘性末端的连接DNA连接酶把相互靠近的5’端磷酸与3’-OH连到一起单酶切、双酶切二、平末端（blunt end）的连接（一） 直接连接T4 DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1~10%。5’ 5’ P--OH3’ P--OH3’ HO-3’ HO--P-P3’ 5’ 5’ 5’ P--OH3’ -PHO-3’ 5’ （二） 人工加尾形成 “粘性末端” （1）同聚加尾法① 原理：DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA的3’-OH端加上脱氧核苷酸。② 加尾－碱基互补分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。③优点：能把任何片段连接起来④缺点：操作繁琐；外源片段难以回收；同聚物尾巴影响外源基因表达。非酶切位点（二） 人工加尾形成 “粘性末端” （2）衔接物（linker）连接Linker：用化学合成法合成的一段10-12bp的，具有一个或数个限制性内切酶识别位点的平末端双链寡核苷酸GGAATTCC CCTTAAGGEcoR I linker：（1）多核苷酸激酶处理（2）T4连接酶连接（3）限制性内切酶消化（4）目的片段与载体连接（3）DNA接头 （adapter）连接法（二） 人工加尾形成 “粘性末端” ① adapter一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）P-5’p-GATCCCGG-OH3’ 3’HO-GGCC-p5’ -PBlunt-ended DNABamHI adapter5‘p-GATCCCGG- GGCC--CCGG -GGCCCTAG-P5’ ② 优点：连上后就能用。③ 缺点：接头与接头以粘末端连接，影响与DNA片段的连接CCGG GGCCCTAG-p5’ 5‘p-GATCCCGG- GGCC-④ 防止自我连接先用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理接头，水解掉其5’端的磷酸，防止自我连接。 5’p-GATCCCGG-3’ GGCC-p5’ BamHI adapterCIP处理Blunt-ended DNA-OHP-5’HO-GATCCCGG3’ GGCC-OH5’ -PHO-T4 ligasenick缺口 5’HO-GATCCCGG- GGCC CCGG -GGCCCTAG-OH5’ nick缺口虽然有缺口，但仍然能与DNA片断连接T4多核苷酸激酶处理使5’磷酸化三、PCR产物的连接1.在引物的5’端设计酶切位点（1）设计原则符合载体的多克隆位点；避免与所扩增的DNA片断内部酶切位点重复。（2）带酶切位点的引物的结构3’端15～20bp与模板互补； 5’端内切酶识别序列＋保护碱基三、PCR产物的连接1.在引物的5’端设计酶切位点请设计一对PCR引物，在N端和C端分别加一个EcoRI（GAATTC，保护碱基GCA）和BamHI酶切位点（GGATCC，保护碱基CGC），另外，各含有18个同该基因同源的核苷酸，能够用于扩增该基因的编码序列。写出P1和P2的引物序列。 带酶切位点的PCR产物-3’ 5’-PCR产物GGATCCGCGGCAGAATTC 3’-CGTCTTAAGPCR产物CCTAGGCGC -5’ EcoR I位点BamH I位点EcoR IBamH IPCR产物G-3’ AATTC 5’-PCR产物-5’ 3’-GCCTAG 两头各有一个粘性末端！三、PCR产物的连接2. 与T载体直接连接载体PCR产物dNTPTaq DNA聚合酶dTTPATATTATA三、Gateway 载体构建系统?噬菌体位点特异性重组系统；高效的实现DNA序列在多种载体系统的转移。入门克隆改造过的各种表达载体三、Gateway 载体构建系统（1）创建入门克隆 BP反应：attB+attP attL+attR，产物：入门克隆入门克隆改造过的各种表达载体√三、Gateway 载体构建系统（2）构建表达克隆 LR反应：attL+attR attB+attP，产物：表达克隆入门克隆改造过的各种表达载体√√第二节 重组体导入受体细胞一、重组DNA导入大肠杆菌（一）转化（transformation）大肠杆菌捕获质粒DNA的过程。（二）转导（transduction）借助噬菌体把外源DNA导入细菌的过程。（三）转染（transfection）受体菌直接捕获噬菌体DNA的过程。（一）转化（transformation）（1）热激法（heat shock）（2）电转化法（electronporation）（3）PEG介导的原生质体转化（4）接合转化（1）热激法制备感受态细胞① 目的增加受体菌细胞膜的通透性感受态细胞：处于能吸收外源DNA分子的生理状态的细胞（1）