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第八章 原位杂交组织化学;原位杂交组织化学（ISHH） 原理： 用标记的DNA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内特定核酸 序列的方法。 特点：杂交在载玻片上的细胞进行。 分类： 根据所用探针和靶核苷酸不同-- DNA-DNA杂交、 DNA-RNA杂交、 RNA-RNA杂交 根据探针标记物是否直接被检测— 直接法、间接法 ;一 原位杂交的由来与发展（一）核酸分子杂交技术;固相杂交： 是将参加反应的一条核酸链固定在固体的支持物上常用的有硝酸纤维素滤膜，其它如尼龙膜、乳胶颗粒和微孔板等），另一条参加反应的核酸链游离在溶液中。 固相杂交技术包括： ① 菌落原位杂交 ② 斑点杂交法 ③ Southern印迹杂交 ④ Northern印迹杂交 ⑤ 组织原位杂交;（二）原位杂交技术的发展;二 原位杂交组织化学基本技术;（一）原位杂交的基本要求; 1 固定 固定剂的应用和选择原则： ① 保持细胞结构； ② 最大限度地保持细胞内DNA或RNA水平； ③ 使探针易于进入细胞或组织。 ;固定剂： 多聚甲醛、醋酸-酒精混合液、Bouin’s固定剂、 Carnoy’s液; 多聚甲醛——mRNA的定位 将组织固定于4%多聚甲醛磷酸缓冲液中1～2h，在冷冻前浸入15%蔗糖溶液中，置4℃冰箱过夜，次日切片或保存在液氮中待恒冷箱切片机或振荡切片机切片。 组织也可在取材后直接置入液氮冷冻，切片后才将其浸入4%多聚甲醛约10min，空气干燥后保存在-70℃。如冰箱温度恒定，在-70℃可保存数月之久不会影响杂交结果。 ;病理学活检取材—— 福尔马林固定和石蜡包埋，这种标本对检测DNA和mRNA有时也可获得杂交信号。 石蜡包埋切片—— 由于与蛋白质交叉连接的增加，影响核酸探针的穿透，因而杂交信号常低于冰冻切片，同时，在包埋的过程中可减低mRNA的含量。 冷冻切片—— 应用多聚甲醛蒸汽固定干燥后的冷冻切片也可获得满意效果。;2 玻片和组织切片的处理;（2）增强组织的通透性和核酸探针的穿透性 根据应用固定剂种类、组织种类、切片厚度和核酸探针长度而定。 常用方法： 稀释的酸洗涤、去垢剂或称清洗剂 Triton X-100、酒精或某些消??酶等。 优点: 通过去蛋白作用增强组织通透性和探针的穿透性,提高杂交信号. 缺点: 减低RNA的保存,影响组织结构形态.因此，在用量及孵育时间上应慎为掌握。;（3）减低背景染色　 　;（4）防止RNA酶的污染　 ① 在整个杂交前处理过程都需戴消毒手套。 ② 所有实验用玻璃器皿及镊子都应于实验前一日置高温烘烤——消除RNA酶,亦可用消毒锅。 ③ 要破坏RNA酶，最低温度必须在150℃左右。 ④ 消毒的玻璃器皿外包以锡箔纸以利于标记和防止取出 时空气污染。 ⑤ 杂交前及杂交时所用的溶液需经高压消毒处理。;3 杂交（Hybridisation）;;杂交注意环节 （1）探针的浓度　 原则:探针浓度必须给予该实验最大的信/噪比值。最佳原 则应是应用最低探针浓度以达到与靶核苷酸的最大饱和结合 度为目的。; （2）探针的长度　 最佳长度应在50～100个碱基之间。 探针短--- 易进入细胞，杂交率高，杂交时间短。 500个碱基的探针--- 杂交时间约需20h左右。 200～500个碱基的探针--- 可应用. 超过500个碱基的探针--- 在杂交前最好用碱或水解酶进 行水解，使其变成短的片段， 达到实验所需求的碱基数。; （3）杂交的温度和时间　　 杂交温度： DNA或RNA需加热或变性、解链后才能进行杂交。原位杂交中，DNA、RNA探针需要的Tm分别是90℃、95℃，这种高温对保存组织形态完整和保持组织切片粘附在载玻片上是不可能的。因此，在杂交液中加入盐和甲酰胺，减低Tm。根据探针的种类不同，温度略有差异。 ;杂交时间： 16-20h或孵育过夜; （4）杂交严格度（Hybridization stringency） 杂交严格度：表示通过杂交及冲洗条件的选择对完全配对及不完全配对杂交体的鉴别程度。 错配对杂交的稳定性较完全配对杂交体差，因此，通过控制杂交温度、盐浓度等，可减弱非特异性杂交体的形成，提高杂交的特异性。所以，杂交的条件愈高，特异性愈强，但敏感性降低，