生物化学实验课件.pptx

生物化学实验课件;概 述 ;实验内容; 生物化学实验技术 郭蔼光 郭泽坤 主编 高等教育出版社 生物化学实验方法与技术 陈毓荃 主编 科学出版社 ;蛋白质的两性性质和等电点测定; 蛋白质是两性电解质。蛋白质分子中可解离基团除N-端α-氨基与C-端 羧基外，还有肽链上某些氨基酸残基的侧链基团，如Phe、Thr、Ser的 羟基、Cys的巯基、Arg的胍基、His的咪唑基，Asn、Gln的酰胺基和 Lys的ε-氨基等都能解离为带电基团。 在蛋白质溶液中存在着下列平衡： 阴离子 两性离子 阳离子 pH＞pI pH = pI pH＜pI 电场中： 移向阳极 不移动 移向阴极 调节溶液的pH使蛋白质分子的酸性解离与碱性解离相等，即所带正负电荷相等，净电荷为零，此时溶液的pH值称为蛋白质的等电点(pI)。 在等电点时，蛋白质溶解度最小，溶液的混浊度最大。配制不同pH的缓冲液，观察蛋白质在这些缓冲液中的溶解情况即可大致确定蛋白质的等电点。在pH梯度电泳中，蛋白质泳动到其相应的等电点时则停止泳动，据此可分离等电点不同的蛋白质。 ; 2.1氨基酸的两性解离和等电点 2.1.1 氨基酸的两性解离;在一定pH值时，氨基酸以兼性离子存在，在电场中不会向正、负酸极移动，此时的pH值称氨基酸的等电点（pI）。 pI= 1/2 (pK1’ +pK2’) 酸性氨基酸 pI= 1/2(pK1’ +pKR’) 碱性氨基酸 pI= 1/2(pK2’ +pKR’);;;2.2 蛋白质的两性电离及等电点;当溶液在某一 pH 值时，蛋白质所带正、负电荷相等，即总净电荷为零，此时溶液的 pH 称该蛋白质的等电点(isoelectric point)。;;;3.仪器、试剂和材料 ;5. 结果处理;7. 思考题 ;蛋白质含量测定（考马斯亮蓝法）;考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）染料，在游离状态下溶液呈棕红色，当它与蛋白质结合后变为蓝色。蛋白质含量在0~1000μg范围内，蛋白质-色素结合物在595nm下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用比色法进行定量分析。考马斯亮蓝G-250法（Bradford法）是比色法与色素法相结合的复合方法，简便快捷，灵敏度高，稳定性好，是??种较好的蛋白质常用分析方法。;3.仪器、试剂和材料 ;5. 结果处理;7. 思考题 ;酶的基本性质;过氧化氢酶广泛分布于生物体内，能将代谢中产生的有害的H2O2分解成H2O和O2，其催化效率比无机催化剂铁粉高10个数量级。 酶的另一特点是具有高度的特异（专一）性，淀粉酶和蔗糖酶虽然都催化糖苷键的水解，但是淀粉酶只对淀粉起作用，蔗糖酶只水解蔗糖。 通过比较淀粉酶在不同pH，不同温度以及有无抑制剂或激活剂时水解淀粉的差异，说明这些环境因素与酶活性的关系。;2.1 pH对酶促反应速度的影响;2.2 温度对酶促反应速度的影响;3.仪器、试剂和材料 ;5. 结果处理;7. 思考题 ;转氨酶活性鉴定（纸层析法）; 转氨酶是生物体氮代谢的重要酶类，动物肝脏和豆类植物萌发种子中存在着丰富的转氨酶。转氨酶催化α-氨基酸的α-氨基与α-酮酸的α-酮基互换，在氨基酸的合成和分解、尿素和嘌呤的合成等中间代谢过程中有重要作用。生物组织中转氨酶种类甚多，其中以谷氨酸-丙酮酸转氨酶(谷丙转氨酶)和谷氨酸-草酸乙酸转氨酶(谷草转氨酶)的活力最强。 通过转氨基作用形成的氨基酸可通过展层层析检测。氨基酸的纸层析属于分配层析，滤纸为支持介质，滤纸上所吸附的水为固定相，有机溶剂为流动相。把混合氨基酸样品点于滤纸上，使流动相经样品点移动，混合氨基酸在两相溶剂间进行分配，在固定相中分配比例较大的氨基酸，随流动相移动的速度慢；在流动相中分配比例较大的氨基酸，随流动相移动的速度快。由于各种氨基酸的分配系数不同，在一定时间内，逐渐集中于滤纸上不同的部位，而彼此分离。层析完毕后显色，使氨基酸显色形成斑点。 氨基酸的比移值（Rf）表示如下： 由于各种氨基酸都有其特征的Rf值，因此可根据Rf值来鉴定被分离的氨基酸。;;;影响纸层析迁移率Rf值的主要因素 1.样品本身的性质和结构 2.溶剂的性质 3.PH值 4.温度 5.滤纸性质;3.仪器、试剂和材料 ;5. 结果处理;7. 思考题 ;淀粉酶活力测定;淀粉