细胞免疫组化.pdfVIP

细胞爬片的免疫组化 1.细胞爬片， 5 天后进行免疫细胞组织化学染色定。 2. PBS 清洗标本 3 次 各 1 min 。 3 .冰丙酮固定 15 min( 或 4% 多聚甲醛固定 30min) 。 4. 空气干燥 5min 。 5. PBS 清洗标本 3 次 各 2 min 。 6. 0.5%Triton X-100( DPBS 配 ) 孵育 1 次 20min 。 7. PBS 清洗标本 3 次 各 2 min 。 8 .3%H2O2 （试剂A ）孵育 15 min 。 9. DPBS 清洗标本 3 次 各 2 min 。 10. 封闭血清孵育（试剂 B ） 20min 。 11 .一抗孵育（滴度 1：200，湿盒） 4 ℃ 过夜或 37℃60 min 。 阴性对照最好用一抗来源血清，否则用 PBS 液 12. PBS 清洗标本 3 次 各 5 min 。 13 .二抗工作液孵育（湿盒试剂 C ） 37 ℃30 min 。 14 .PBS 清洗标本 3 次 各 5 min 。 15. 试剂 D （湿盒） 37℃ 30 min 。 16、PBS 清洗标本 3 次 各 5 min 。 17、DAB 显色（避光，镜下观察至棕色 ） 约 3~10min 。 18、蒸馏水洗 2 次 1 min 。 19、苏木素复染 0.5~1min 。 20 、自来水洗返蓝。 21.梯度酒精脱水 75，85 ，95 ， 100%各 3min 。 22.二甲苯透明 2 次 3min 。 23 、中性树胶封片。 注意事项： 1、良好的细胞爬片是进行免疫组织细胞的基础，要获得良 好细胞爬片须注意以下： a 对于粘附分子较少的细胞爬片时间要达 5 天以上这样细胞 爬片才较牢固冲洗时不易脱片； b 接种的细胞密度适中以 2*104/ml 为宜， 若密度太高 5 天后 细胞连接成片冲洗时易脱片； 2、冰丙酮固定后玻片可密闭保存于 4C 冰箱，冰丙酮固定时 会使细胞收缩，可用 80%冰丙酮或 2%多聚甲醛固定。 3、冲洗时只须轻轻振荡培养皿，（不可用吸管太用力吹， 易脱片） 4 、加一抗、二抗后冲洗时第一次须将玻片倾斜 5、Triton X-100 表面活性剂，脱去细胞膜中最主要的成分脂 质，对于抗原表达在胞浆或胞核者方使用，对于抗原表达在 胞浆者时间要控制好，使其破坏细胞膜而核膜破坏较少。 细胞爬片固定后在孔板里做免疫组化还是粘到载玻片上再 做？ 1.如果不看荧光，两种都可以，感觉粘好了再做要快一些， 但是做的时候要防止脱落。 如果看荧光，就不能用中性树胶粘，直接在 24 孔，或 6 孔 板里做才可以。中性树胶要折光，散射的光干扰，没办法看 细胞本身的荧光。 2.孔板里做免疫组化较方便，细胞比盖玻片易贴壁，但染色 后不能用二甲苯透明、封片（可用甘油）。 细胞爬片固定后粘到载玻片上不太可能，只有开始就让细胞 贴在玻片上爬片。 3.我没有在多孔板里做过，其实把细胞爬在盖玻片上也不是 很麻烦，偶这样做很少掉片。 先将消化好的细胞悬液滴几滴在盖玻片上，由于液体的表面 张力，细胞悬液一般不会流淌到盖玻片外面，等细胞大概贴 壁后，不同细胞贴壁时间稍有不同，大概 6、7 个小时，差 不多贴壁再加生长液，开始滴的细胞的数量你要摸索一下， 到固定时细胞生长到