毒胡萝卜素诱导肝癌HepG2细胞凋亡与自噬和调控机制研究.doc

毒胡萝卜素诱导肝癌HepG2细胞凋亡与自噬及调控机制的研究 王丛丛，张 燊，邓思君，张朝明，周 延，汤树生，肖希龙作者简介：王丛丛（1985-），女，汉族，山东德州人，博士，主要从事分子毒理学研究。 作者简介：王丛丛（1985-），女，汉族，山东德州人，博士，主要从事分子毒理学研究。 *通讯作者：肖希龙教授： xiaoxl@cau.edu.cn （中国农业大学动物医学院， 北京 100193 congcongwang@cau.edu.cn） 摘 要：【目的】近几年研究发现，内质网应激能够引起细胞凋亡和自噬。毒胡萝卜素 (TG) 是一种不可逆性内质网钙ATP酶抑制剂，在多种细胞能够引起内质网应激介导的细胞凋亡与自噬。因此，本实验旨在探讨毒胡萝卜素对人肝癌HepG2细胞凋亡与自噬的影响及其调控机制。【材料与方法】体外培养肝癌HepG2细胞，经不同浓度TG干预24小时，分别用Hochest33342染色和罗丹明123检测细胞凋亡形态和线粒体膜电位的变化。生长对数期用1 μM的TG分别处理24 h、36 h、48 h、60 h和不同浓度TG (1 μM、2 μM、4 μM、8 μM) 处理24小时诱导HepG2细胞，流式细胞术检测TG引起的HepG2细胞凋亡的变化。同时应用Western blot检测凋亡相关蛋白Caspase-3， Bcl-2，Bax，以及线粒体通路相关蛋白Caspase-9，Cytochrome C (Cyt C) 和内质网通路相关蛋白Caspase12的表达情况。体外培养肝癌细胞HepG2细胞，经不同浓度TG (1 μM、2 μM、4 μM、8 μM) 作用 24小时和0.5 μM的TG分别处理24 h、36 h、48 h、60 h后，采用MDC染色，荧光显微镜观察自噬囊泡，流式细胞术检测其荧光强度。pGFP-LC3质粒瞬时转染HepG2细胞，TG处理24 h后，荧光显微镜检测自噬。Western blot 检测自噬相关蛋白LC3 II / I、Beclin1、DAPK1的表达情况。【结果】TG作用24小时后，HepG2细胞呈典型的凋亡细胞形态。与空白对照组相比，线粒体膜电位显著下降，且呈浓度依赖性。TG作用HepG2细胞后，细胞凋亡率均明显升高，且在一定范围内呈浓度和时间依赖性。免疫印迹法结果显示，凋亡相关蛋白Caspase-3，Caspase-9均发生了剪切表达量下降，抑凋亡蛋白Bcl-2表达减少，促凋亡蛋白Bax和Cyt C表达增加，同时内质网应激相关蛋白Caspase12表达量也显著上升，且在一定范围内呈浓度和时间依赖性。经不同浓度TG 作用24小时和同一浓度不同时间处理的HepG2肝癌细胞在细胞质可见明显聚集的点状MDC阳性荧光颗粒，且流式细胞术结果显示，自噬发生率在一定的范围内呈时间和浓度依赖性。GFP-LC3在攻毒细胞组中出现明显点状聚集，其数量呈时间依赖性增加。免疫印迹法结果显示，LC3 II / I表达量比值呈时间、剂量依赖性增加，Beclin1和DAPK1的蛋白表达水平随处理时间和浓度的增加，表达量也逐渐增加。【结论】TG可诱导人肝癌HepG2细胞发生凋亡，其机制可能与线粒体通路和内质网应激有关。同时通过激活Beclin1引起HepG2细胞发生自噬。