《生物制药工艺学》第7章凝胶层析.ppt

* 样品入透析袋入干颗粒中 将SephadexG-25或50干胶投入到稀的高分子溶液中，吸水后 再经离心或过滤，将溶胀的凝胶分离出去，就得到了浓缩的高分子溶液。 * 分子量测定的误差小，常用于蛋白质、酶、多肽等大分子药物的分子量测定 * 热原：指由微生物产生的能引起恒温动物体温异常升高的致热物质。主要是指细菌性热原，是某些细菌的代谢产物、细菌尸体及内毒素。 * 用葡聚糖凝胶分离多组分混合物除利用分子筛效应外，还可以利用某些物质与凝胶具有程度不等的弱吸附作用。 * Tswett茨维特 * 流动相中样品混合物经过固定相时，就会与固定相发生作用，由于各组分在性质和结构上的差异，与固定相相互作用的类型、强弱也有差异，因此在同一推动力的作用下，不同组分在固定相滞留时间长短不同，从而按先后不同的次序从固定相中流出。 层析法是近代生物化学最常用的分析方法之一，运用这种方法可以分离性质极为相似，而用一般化学方法难以分离的各种化合物，如各种氨基酸、核苷酸、糖、蛋白质等。 * 吸附层析：固定相是固体吸附剂，组份在吸附剂表面吸附各能力不同 离子交换层析：固定相是离子交换剂，各组份与离子交换剂亲和力不同 凝胶层析：固定相是多孔凝胶，各组份的分子大小不同，因而在凝胶上受阻滞的程度不同 亲和层析法：固定相只能与一种待分离组份专一结合，以此和无亲和力的其它组份分离 柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离。 纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目的。 薄层层析：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸层析类似的方法进行物质的分离和鉴定。 薄膜层析法：将适当的高分子有机吸附剂制成薄膜，以类似纸层析方法进行物质的分离 * Vo：外体积(outer volume) Vi：内体积(inner volume) 内水 填料孔体积 外水 填料颗粒间体积 * Ve：为洗脱体积(elution volume) Vi，ace是某种大分子渗透进去的那部分孔体积 * 三种不同分子量物质的混合样品用某种规格的凝胶柱进行分离。 样品加入，以水或其他溶液进行洗脱，即得洗脱曲线 。 * 有时可能会出现VeVA，这是由于这种分子与凝胶有吸附作用造成的。? * 3-氯-1，2-环氧丙烷 * 分离范围 * 规格除了标明编号外，还应标明粒度范围，粒度大小不会影响分离效果，可根据需要选用 * 1M盐酸 100度处理2小时，0.25M氢氧化钠 60度60d，1kg/cm2 30min 增加离子强度 先用惰性蛋白饱和 * 为了扩大葡聚糖凝胶在有机溶剂中的应用范围 * 从Bio-Gel P-2至Bio-Gel P-300。P后面的阿拉伯数字乘以1000即相当于排阻限度（按球蛋白或肽计算）。 粒度： P-2至P-10：粗，中，细，极细 P-30至P-300：粗，中，极细 * 键能比较弱 稳定性差 遇脱水、干燥、冷冻、加热40度失去原有性能 无带电基团 无吸附 特征：分离范围非常大 超过生物凝胶和葡聚糖凝胶 使凝胶层析的分离区间扩大到大分子和病毒颗粒，其最大范围可达相对分子质量108 * 与硼酸形成配位化合物 * 选择适宜的凝胶是取得良好分离效果的最根本保证。何种凝胶，型号，粒度 考虑凝胶的性质：分离分子量范围，理化稳定性，强度，非特异性吸附等 分离目的和样品的性质 * 蛋白大于5000 盐一般几十到几百 * 但G200强度低 有时也选用G150来进行分离 * 颗粒要均匀 过筛 * 大柱长柱 分离效果好，流速慢，费时长，样品稀释 * 正确的装柱是清除影响样品中层析系统中正常流动因素的关键和前提 为避免胶粒直接冲击支持物，留1/5 凝胶必须是用相应溶剂充分溶胀的 装柱时 应打开柱阀门保证一定的流速 太浓 难以均匀装柱，太稀 费时长 不易连续装柱，容易分层 将层析柱垂直固定，加入适量溶剂排走空气。---装-----平衡 * 一般用3～5倍体积的缓冲液在恒压下流过柱床。 * 由于层析的稀释租用---浓度应该大才好，但是过大粘度增大，层析分辨率下降。 * 如果糖不影响层析结果，可在样品中加入1%的葡萄糖或蔗糖-----洗脱液1cm时加入 * 防止柱床体积变化，造成流速降低及重复性下降 * 一般无需再生便可多次重复使用。 不溶物污染时 必须重新出柱，反复漂洗，再用稀酸稀碱或其他溶剂浸泡处理 * 一般Vo占Vt的30%左右 太大则柱床未稳定。 相同型号凝胶 粗粒Vo大于细粒 * 上行层析 用微量泵控制 上下均装 反转柱 * 分子量极为相近的组分 循环中 防止流动快点组分赶上流动慢的组分 重新混合 一般采用自动分析装置 检出并出去无用组分 * 小而均匀的填料 减小扰动作用 适当溶剂 使溶质的扩散系数