GMO检测常用技术方法.pptVIP

学习文档 学习文档 学习文档 学习文档 二、核酸分子杂交技术 核酸分子杂交 是指单链核酸分子（DNA或RNA）在特定条件下，与另一条互补的特异核酸链形成稳定双链的过程。 主要依据： 碱基互补、变性和复性 DNA与DNA杂交： A=T、 G≡C ; DNA与RNA杂交: A=U、 G≡C ; 变性： 在一定温度下，使核酸双链解开为两条单链； 复性： 随温度逐渐恢复，变性的两条单链重新形成互补双链 碱基互补 学习文档 γ β α 学习文档 hybridization DNA:DNA 5’ A T G C C G A T 3T A C G G C DNA:RNA 5’ A T G C G T A 3’ U A C G C A U RNA:RNA 5’ A U G C U A C G 3’ U A C G A U G C 学习文档 利用核酸双链的碱基互补、变性和复性的原理，可以用已知碱基序列的单链核酸片段作为探针，与待测样本中的单链核酸互补配对，以判断有无互补的同源核酸序列的存在。 核酸探针 是指带有标记的某一特定DNA或RNA片断，能与待测样本中单链核酸分子互补配对结合，进而检测同源序列。 探针标记物 有放射性核素和非放射性核素（生物素、地高辛、荧光素等）两大类。 学习文档 2.1.核酸分子杂交的分类 液相杂交： 待测核酸样本与特异性探针同时溶于杂交液中进行杂交反应； 固相杂交： 待测核酸样本先结合到固相支持物上，再与溶液中的特异性探针进行杂交反应。 常用固相杂交支持物： 硝酸纤维素膜、尼龙膜等 学习文档 2.2.核酸分子杂交（固相杂交）操作程序 制备待测核酸样品 分离、变性、转移、固化DNA片段 杂交 加入标记核酸探针 检测杂交信号 标记核酸探针 预杂交 制备核酸探针 漂洗去除未参与杂交的标记探针 学习文档 2.3. 常用固相核酸杂交方法 Southern 印迹杂交法（Southern blotting ） Northern 印迹杂交法（Northern blotting ） 斑点杂交或狭缝杂交法 （Spot/ Slot blot hybridization） 原位杂交（nucleic acid hybridization in situ） 学习文档 (1) Southern 印迹杂交法 （Southern blotting ） DNA/DNA杂交，即将DNA电泳、转印到固相支持物上，用探针进行检测的方法。 学习文档 学习文档 southern印迹 PV膜 凝胶 吸水纸 缓冲液 滤纸 固定到载体 学习文档 （2）Northern 印迹杂交法 （Northern blotting ） （其基本过程类似于上述Southern法） 提取RNA样本→RNA变性→琼脂糖凝胶电泳分离→转移至膜→探针（标记DNA或RNA）与之杂交→显影或显色→检测信号。 Northern法可用于检测组织细胞中总RNA或mRNA 学习文档 （3）斑点杂交或狭缝杂交法： 基本过程： 将变性的DNA或RNA直接点到固相支持滤膜上→用标记探针与之杂交→自显影或显色反应→检测杂交信号→分析结果。 优点： 简便、快速、灵敏、样本用量少； 缺点： 特异性不高，有一定比例的假阳性。 学习文档 学习文档 （4）原位杂交（nucleic acid hybridization in situ） 将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交，进而检测特异的DNA或RNA序列。 细胞原位杂交 组织切片原位杂交 DNA-