真核表达系统的选择和高效表达策略.pptxVIP

微生物基因工程 李刚 副教授教学内容一、PCR引物的设计与实验操作技巧；二、基因组文库的建立与筛选；三、定向进化技术在微生物酶制剂研究中 的应用；四、原核表达系统的选择和高效表达策略；五、真核表达系统的选择和高效表达策略。五、真核表达系统的选择和高效表达策略 真核生物表达系统主要包括： 酵母表达系统、杆状病毒表达系统、哺乳动物细胞表达系统、　转基因植物表达系统、　杜氏盐藻生物反应器等五种表达系统。 其中应用最广泛的是酵母表达系统。真核表达系统的优点真核表达系统具有翻译后的加工修饰体系,表达的外源蛋白更接近于天然蛋白质。酵母表达系统主要包括酿酒酵母、裂殖酵母、克鲁维酵母、甲醇酵母等表达系统。其中甲醇酵母基因表达系统是一种最近发展迅速的外源蛋白质生产系统，也是目前应用最广泛的酵母表达系统。主要有H. polymorpha、Candida Bodinii、Pichia Pastoris三种, 其中Pichia Pastoris作为基因表达系统使用得最多、最广泛。由于它具有无可匹敌的高表达特性,已被认为是最具有发展前景的生产蛋白质的真核表达系统之一。酵母表达系统的优点①酵母长期广泛应用于酿酒和食品工业, 不会产生毒素, 安全可靠; ②酵母是真核生物, 能进行一些表达产物的加工, 有利于保持生物产品的活性和稳定性; ③外源基因在酵母中能分泌表达,表达产物分泌至胞外不仅有利于纯化, 而且避免了产物在胞内大量蓄积对细胞的不利影响; ④遗传背景清楚, 容易进行遗传操作; ⑤ 较为完善的表达控制系统, 如PMA1 和PDR5 等强启动子可以介导目的蛋白高水平表达, 表达蛋白的丰度可以达到膜蛋白的10%; 酵母表达系统的优点此外, 采用诱导表达启动子可以在时间上严格控制目的蛋白的表达, 如GAL1- 10( 半乳糖诱导) 、PH05( 胞外无机磷诱导) 和HSE( 37℃温度诱导) ; ⑥生长繁殖迅速, 培养周期短, 工艺简单, 生产成本低。酵母菌用于真核基因的表达、分析, 既具有原核表达系统生长迅速、操作简单、价格便宜等优点, 又具有类似哺乳动物细胞的翻译后修饰过程, 因而特别适用于大量生产真核重组蛋白, 正是由于有这些优点, 使酵母功能基因组的研究得以走在生物功能基因组研究的前列, 是应用最为普遍的真核表达系统之一。杆状病毒表达系统昆虫杆状病毒表达系统是目前国内外十分推崇的真核表达系统。利用杆状病毒结构基因中多角体蛋白的强启动子构建的表达载体,可使很多真核目的基因得到有效甚至高水平的表达。它具有真核表达系统的翻译后加工功能,如二硫键的形成、糖基化及磷酸化等,使重组蛋白在结构和功能上更接近天然蛋白;其最高表达量可达昆虫细胞蛋白总量的50%;可表达非常大的外源性基因(～200kD);具有在同一个感染昆虫细胞内同时表达多个外源基因的能力;对脊椎动物是安全的。由于病毒多角体蛋白在病毒总蛋白中的含量非常高,至今已有很多外源基因在此蛋白的强大启动子作用下获得高效表达。哺乳动物细胞表达系统与其他的真核表达体系相比,哺乳动物细胞表达的蛋白与天然蛋白的结构、糖基化类型和方式几乎相同且能正确组装成多亚基蛋白,但成本较高。近年来,研究者们主要通过改造宿主细胞和基因导入方法来提高外源蛋白的表达效率。哺乳动物细胞表达系统常用的宿主细胞有CHO、COS、BHK、SP2 /0、N IH3T3等。将外源基因导入哺乳动物细胞内的方法,主要有化学法、电穿孔法、基因枪法和哺乳动物病毒载体系统等。　转基因植物表达系统转基因植物是指利用一定的手段将外源性或内源性的基因导入到植物体内,使植物的遗传性状改变而产生的植物体。 转基因植物作为生物反应器已在药物蛋白的生产中被广泛使用,成功表达的药用蛋白质和多肽有:人的细胞因子、表皮生长因子、促红细胞生成素、干扰素、生长激素、单克隆抗体等. 烟草、马铃薯、大豆、香蕉、莴苣、羽扇豆等作为生物反应器生产口服疫苗,也得到了人们的广泛关注。 转基因植物疫苗和药用蛋白的表达系统主要有农杆菌介导的核转化系统、植物病毒瞬时高效表达载体和植物叶绿体高效表达系统。 在研究成功的转基因植物药用蛋白中, 80%是由农杆菌介导形成的转基因植物表达系统生产。在重组药物的多种表达体系中,转基因植物是最经济的。同一种重组蛋白在植物中的生产成本是微生物发酵体系的2% -10% ,是哺乳动物细胞生产的0.1%。杜氏盐藻生物反应器杜氏盐藻是一种单细胞真核藻类,没有细胞壁，原生质外仅有一层糖蛋白和神经氨酸组成的外膜，具有一个杯状、大型的叶绿体,体积约占细胞的一半。 盐藻是极其耐盐的，可以在0. 05 - 5 mol/ l氯化钠的极端环境中生存。盐藻属于光和自养生物,能利用简单的培养基进行培养，富含β胡萝卜素、甘油、蛋白质等。盐藻作为新型的真核生物反应器，除了具有转录和翻译后的加工