间接红细胞凝集试验诊断血吸虫病.pptxVIP

间接红细胞凝集试验（Indirect haemagglutination test, IHA） ;国外最早于1955年应用于检测马抗血清 国内陶义训等（1958）首先应用于诊断 日本血吸虫病 杨赞元等（1976）应用冰冻干燥方法 制备试剂;一、基本概念 ;（二）间接红细胞凝集试验 ;（三）间接血凝的类型 ;（正向）间接凝集反应;反向间接凝集反应;间接凝集抑制反应;（一）血吸虫虫卵抗原制备 分离虫卵→ 脱水、脱酯干燥→ 研磨成细粉 → 冻融→ 超声粉碎→ 普通离心→ 高速离心。 经离心后的上清液，即为虫卵抗原原液，保存于 -20℃中备用。;理想抗原 敏感性高，特异性强，能区别不同感染度，能区别现在感染还是过去感染，价廉。 但目前还没有，今后可能依靠杂交瘤技术、DNA技术而获得理想的抗原。;取人“O”型血红细胞3份（不同个体）混合 ，用生理盐水洗涤 。置冰浴内，将戊二醛溶液慢慢滴入红细胞悬液中，边加边摇，醛化1h。用1/10000的柳硫汞蒸馏水配成10%的红细胞悬液，置于4℃备用。; 醛化红细胞优点 克服了个体差异，保证实验重复性 延长红细胞的保存时间，在4℃可保存1年 避免操作过程中因振荡、低渗、冻融使红细胞破裂、溶血;取1/10000鞣酸溶液与等量2.5%红细胞悬液混匀，置于37℃ 中15min，并不断摇动。洗涤，去除多余的鞣酸。;鞣化红细胞的优点 鞣化后红细胞易吸附蛋白抗原。 ;取虫卵抗原原液1:100稀释，与2.5%的鞣化红细胞等量混合，置于37℃水浴中30min，并不断摇动，然后离心，洗涤，去除多余抗原。 用含有5%蔗糖及1%正常兔血清（56℃灭活）的pH7.2PBS保护液，配成10%浓度的致敏红细胞悬液。 致敏效果与抗原的活性及纯度有关。;将上述致敏红细胞悬液摇匀，分装于2ml安瓿内。每支0.4ml，立即放入-40℃冰箱冰冻，待全部分装完毕后，移入冰冻干燥机内，冰冻干燥约24h，干燥后封口，保存于4℃中备用。 冰冻干燥具有高科技含量不是单纯干燥，在冰冻状态下使水分子升华，不使红细胞破裂，不影响抗原活性。;三、操作步骤;（三）第1孔中加待检血清25μl，混匀后吸出25μl加于第2孔中，在第2孔中混匀后，吸出25μl加于第3孔中，混匀后弃去25μl。此时第1、2、3孔中的血清稀释度依次为1:5 、1:10 、1:20。 （四）在第2、第3孔中各加致敏红细胞悬液25μl，将反应板放在振荡器上振荡1min，室温下静置45min，观察反应结果。;四、反应标准;（三）反应强度 “-”：红细胞全部下沉在凹底部，形成紧密的 圆点，周围整齐清晰 “+”：多数红细胞下沉在凹底部形成圆点，周围可见少量凝集红细胞 “++”：凹底部可见明显的红点，凝集红细胞在底部形成小薄层;“+++”：凹底部可见很弱的红点，红细胞呈 疏松的颗粒凝集 “++++”：红细胞呈明显的颗粒凝集，均匀 散布于凹底部周围形成薄层，有时呈皱褶状 效价(滴度)：发生凝集现象最高的血清稀释度。;五、影响因素及注意事;（五）生理盐水：用于稀释IHA试剂、阳参、阴参、血清样本的生理盐水必须保持无菌。 （六）判断反应结果：在判断反应结果时应在反应板下面衬一张白纸，使反应结果更加清晰。先观察空白对照、阴参、阳参，再观察样本。;六、评价;七、实用价值; 谢谢大家！;（二）间接红细胞凝集试验 ;反向间接凝集反应;三、操作步骤;五、影响因素及注意事;（五）生理盐水：用于稀释IHA试剂、阳参、阴参、血清样本的生理盐水必须保持无菌。 （六）判断反应结果：在判断反应结果时应在反应板下面衬一张白纸，使反应结果更加清晰。先观察空白对照、阴参、阳参，再观察样本。;六、评价