新冠核酸检测扩增检测操作规程SOP(之江)核酸扩增和Pcr是一回事吗.doc

SOP_18-37 新型冠状病毒2019-nCoV基因 (之江)扩增检测操作规程 1.名称 新型冠状病毒（2019-nCoV）RNA 2.目的 规范新型冠状病毒（2019-nCoV）RNA荧光定性PCR项目检测试验，确保检测结果的准确性和重复性。 3.方法 TaqMan探针实时荧光定性。 4.检测原理 本试剂盒采用 RNA 逆转录反应以及聚合酶链式反应（PCR）结合 Taqman 技术，根据病毒的核酸序列设计特异性的引物用于扩增对应的核酸片段，同时，高度特异性的 TaqMan 探针可与对应的核酸片段进行结合，并在 Taq酶外切酶活性作用下发生水解，产生荧光信号，根据荧光信号与扩增循环数之间的关系可得到实时扩增曲线。 本试剂盒中以 2019-nCoV 的 ORF1ab 基因，E 基因和 N 基因为检测对象，从而实现对 2019-nCoV 核酸的检测。 5.样品 咽拭子、痰液等 6.试剂 上海之江生物科技股份有限公司 序号 组分 包装规格 50人份/盒 1 2019新型冠状病毒核酸荧光PCR检测混合液 988 ul×1 2 RT-PCR酶 52 ul×1 3 2019新型冠状病毒内标 60ul×1 4 2019新型冠状病毒阴性对照品 400ul×1 5 2019新型冠状病毒阳性对照品 400ul×1 注 ：不同批号的组分不可以互换使用。酶在使用前应低速离心数秒，以收集管壁或管盖残留成分。其它组分使用前应在室温下融解，旋涡震荡数秒，充分混匀，低速离心数秒后使用。 7.仪器 苏州雅睿生物技术有限公司MA-6000实时荧光定量 PCR 仪。 8.操作步骤 8.1PCR试剂准备（I区） 8.1.1从试剂盒中取出PCR检测混合液、RT-PCR酶、内标，室温融化后振荡混匀，8,000rpm 离心数秒后使用。 8.1.2取N个（N＝待测样本个数+阴性对照品+阳性对照品）PCR反应管将各组分充分混合后进行短时离心，以使管壁上的液体全部离心至管底，之后将20ul扩增体系分装到PCR管中。将装有PCR反应液的PCR管置I区～II区传递窗。 NC单人份扩增体系配制如下表： PCR检测混合液 RT-PCR酶 扩增体系 19ul 1ul 20ul 8.1.3 每次完成配液操作后，用75%的酒精清洁实验室台面，用2000mg/L含氯消毒剂清洁实验室地面，打开实验室紫外线，人员退出实验室。 8.2核酸模板提取（II区） 核酸提取:取200ul液态样本进行核酸提取。采用西安天隆科技有限公司提供的核酸提取或纯化试剂盒；具体操作步骤请按照试剂盒说明书指引进行。 8.3加样（II区） 在配制好体系的PCR反应管中分别加入处理后的阴性对照品、待测标本核酸、阳性对照品各5ul，盖紧管盖，8,000rpm离心数秒后，置II区～III区传递窗。 标本制备区清洁：每次完成试验操作后，医疗垃圾用2000mg/L含氯消毒剂喷洒至完全湿润，用鹅颈式封扎，带出二区高压处理后按规范处置。用75%的酒精清洁实验室台面，用2000mg/L含氯消毒剂清洁实验室地面，打开实验室紫外线，人员退出实验室。 8.4 PCR扩增检测（III区） 8.4.1将PCR反应管放入荧光PCR扩增仪进行扩增检测。 8.4.2循环参数设定： 序号 步骤 温度 时间 循环数 1 反转录反应 45? 10分钟 循环1次 2 预变性 95? 3分钟 循环1次 3 变性 95 15秒 循环45次 退火、延伸及检测荧光 58 30秒 8.4.3样品设置 在仪器软件的相应样品设置窗口内填写各样品的名称、类型。 9. 基线和阈值设定 基线通常按照仪器自动设置的基线即可。基线调整原则：选择指数扩增前荧光信号较稳定的区域，起点（Start）避开荧光采集起始阶段的信号波动，终点（End）比最早出现指数扩增的样本 Ct/Cq 值减少1-2 个循环。阈值设定原则为阈值线刚好超过阴性对照品检测荧光曲线的最高点。 10.质控标准 10.1阴性对照品：FAM、VIC和ROX检测通道无明显扩增曲线，Cy5通道CT值≤35且具有 S 型扩增曲线。 10.2阳性对照品：FAM、VIC和ROX检测通道CT值≤30且具有S型扩增曲线，Cy5通道有或无扩增曲线。 10.3应同时满足上述2项条件，否则试验无效。 10.4每批上样检测应当在剩余加样孔中设置1个弱阳性质控样本和三个阴性质控样本（2份生理盐水和1份阴性对照品）。3份阴性质控样本随机放在临床样本中间。弱阳性质控测定为阳性，3个阴性质控全部测定为阴性，视为在控。反之，则为失控，不可发出报告，应分析原因，必要时重新检测样本。 11.结果判断 在质控品正常的情况下，结果判断如下： 2019新型冠状病毒核酸荧光PCR检测混合液 结果判断 若FAM 通道Ct值≤43，且扩增曲线呈典型的S型，则结果判断为