新冠核酸检测扩增检测操作规程SOP(金豪).doc

SOP_18-36 新型冠状病毒2019-nCoV基因 (金豪)扩增检测操作规程 1.名称 新型冠状病毒（2019-nCoV）RNA 2.目的 规范新型冠状病毒（2019-nCoV）RNA荧光定性PCR项目检测试验，确保检测结果的准确性和重复性。 3.方法 TaqMan探针实时荧光定性。 4.检测原理 根据荧光PCR技术原理，针对2019-nCoV目的基因ORF1ab与N基因设计特异性引物和Taqman探针，通过荧光PCR检测仪进行检测，从而实现对2019-nCoV的定性检测。试剂盒以正常人上皮细胞中广泛存在的核糖核酸酶P（RNase P，RNP）的mRNA为正常人体细胞对照，对提取和检测过程进行监控。 5.样品 咽拭子、痰液等 6.试剂 北京金豪制药股份有限公司，新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法） 成分 规格48T 数量 主要成分 2019-nCoV ORF1ab/N 反应液 0.9mL/管 1管 含dNTPs、MgCl2、2019-nCoV的ORF1ab/N基因及RNP特异性PCR引物和荧光探针的混合液 酶混合液 100ul/管 1管 逆转录酶、DNA聚合酶、RNA酶抑制剂 阴性对照 1.0mL/管 1管 无核酸水 阳性对照 200ul/管 1管 含ORF1ab基因、N基因、RNP的假病毒混合物 7.仪器 苏州雅睿生物技术有限公司MA-6000实时荧光定量 PCR 仪。 8.操作步骤 8.1 PCR试剂准备（I区） 8.1.1从试剂盒中取出2019-nCoV ORF1ab/N 反应液、酶混合液，室温融化后振荡混匀，掌上离心机离心10秒后使用。 8.1.2取N个（N＝待测样本个数+阴性对照品+阳性对照品）PCR反应管将各组分充分混合后进行短时离心，以使管壁上的液体全部离心至管底，之后将20ul扩增体系分装到PCR管中。将装有PCR反应液的PCR管置I区～II区传递窗，传递至标本制备室，如不能尽快使用，可暂放与4度冰箱冷藏，2小时内用完。 NC单人份扩增体系配制如下表： PCR检测混合液 RT-PCR酶 扩增体系 18ul 2ul 20ul 8.1.3 每次完成配液操作后，用75%的酒精清洁实验室台面，用2000mg/L含氯消毒剂清洁实验室地面，打开实验室紫外线，人员退出实验室。 8.2核酸模板提取（II区） 核酸提取:取200ul液态样本进行核酸提取。采用西安天隆科技有限公司提供的核酸提取或纯化试剂盒陕西械；具体操作步骤请按照试剂盒说明书指引进行。 8.3加样（II区） 在配制好体系的PCR反应管中分别加入处理后的阴性对照品、待测标本核酸、阳性对照品各5ul，盖紧管盖，8,000rpm离心数秒后，置II区～III区传递窗。 标本制备区清洁：每次完成试验操作后，医疗垃圾用2000mg/L含氯消毒剂喷洒至完全湿润，用鹅颈式封扎，带出二区高压处理后按规范处置。用75%的酒精清洁实验室台面，用2000mg/L含氯消毒剂清洁实验室地面，打开实验室紫外线，人员退出实验室。 8.4 PCR扩增检测（III区） 8.4.1将PCR反应管放入荧光PCR扩增仪进行扩增检测。 8.4.2循环参数设定： 步骤 反应温度 时间 是否采集荧光 循环数 逆转录及变性 50 30分钟 否 1 95 3分钟 否 扩增及荧光收集 95 10秒 否 40 55 30秒 是 8.4.3样品设置 在仪器软件的相应样品设置窗口内填写各样品的名称、类型。 9. 基线和阈值设定 基线通常按照仪器自动设置的基线即可。基线调整原则：选择指数扩增前荧光信号较稳定的区域，起点（Start）避开荧光采集起始阶段的信号波动，终点（End）比最早出现指数扩增的样本 Ct/Cq 值减少1-2 个循环。阈值设定原则为阈值线刚好超过阴性对照品检测荧光曲线的最高点。 10.质控标准 10.1每批上样检测应当在剩余加样孔中设置1个弱阳性质控样本和三个阴性质控样本（2份生理盐水和1份阴性混合样本）。3份阴性质控样本随机放在临床样本中间。弱阳性质控测定为阳性，3个阴性质控全部测定为阴性，视为在控。反之，则为失控，不可发出报告，应分析原因，必要时重新检测样本。 10.2每次试应应设置阳性对照和阴性对照，且符合以下要求，否则试验结果不成立。 10.2.1 10.2.2 10.2.3 11.结果分析 11.1阳性判断见下表 阳性值结果判断 结果判断 阳性结果判断CT值 阴性 无CT值 阳性 0CT≤38.0 灰区 38.0CT40.0 11.2样本孔结果判读模式如下： FAM通道 （ORF1ab） HEX通道 （N基因） ROX通道 （RNP基因） 结果判