新版dpph自由基清除实验-实验流程图-操作图解-李熙灿-Xican-Li.docVIP

PAGE 2 DPPH自由基清除/PTIO自由基清除实验：实验流程图2018.4 【前言】体内（细胞内）的自由基，可以分为两类：活性氧（ROS，Reactive oxygen species）和活性氮（RNS，Reactive nitrogen species）。ROS主要有羟基自由基·OH，过氧自由基(·O2-)，脂质过氧自由基(LOO·)等；RNS主要有一氧化氮（·NO）等。这些ROS和RNS如果过量堆积，会引起氧化应激，发生各种病变，加速机体衰老。 许多植物（特别是中药），对ROS和RNS都有较强的清除作用，这种清除作用可以缓解氧化应激，故称为抗氧化。为了评价抗氧化活性的强弱，生物化学家建立了一系列的评价方法。最常见的是DPPH自由基清除法。DPPH自由基结构如下： 其全称有数个：（1）1,1-二苯基-2-三硝基苯肼基自由基；（2）1,1-二苯基-2-苦肼基自由基；（3）2,2-二苯基-1-苦肼基自由基；（4）2,2-二苯基-1-三硝基苯肼基自由基；（5）α,α-二苯基-β-苦肼基自由基。尽管如此，其简称都是“DPPH自由基”。 RNS 和ROS都是不稳定的（如·OH，·O2-， LOO·，·NO），很难直接评价。不过，DPPH自由基较稳定，因为N原子上那个成单电子，可以与苯环形成p-π共轭。稳定的DPPH自由基的甲醇或乙醇溶液呈深紫红色，并在519 nm范围有最大吸收峰。当向DPPH自由基溶液中加入自由基清除剂(抗氧化剂)时，成单被配对，深紫色的DPPH自由基被还原成黄色DPPH-H分子，其褪色程度与所接受的电子数量成定量关系，因而可以通过吸光度的变化进行定量分析。当DPPH自由基与抗氧化剂反应后，519nm波长处的吸收值降低，其降低的程度与接收的电子（抗氧化剂清除自由基活性）呈定量关系，可以用分光光度计测定。 不过，从结构式中可以看也，其成单电子位于N原子上，所以，是RNS而不是ROS。所以， 严格讲，DPPH法只能用于评价RNS清除水平而不是ROS清除水平。如果要评价ROS清除水平，必须用相对稳定的氧自由基。PTIO自由基，即是一种相对稳定的氧自由基。 由结构式可知，PTIO自由基的成单电子是位于氧原子上的，而且，旁边有大的π-π共轭体系，所以，其结构相对稳定。其甲醇溶液呈深紫色，并在586 nm范围有最大吸收峰；其水溶液呈深紫色，并在557nm范围有最大吸收峰。所以，既可以用水作溶剂，也可以用甲醇作溶剂。具体，则视样品的溶解性而定。 如果能将DPPH自由基清除和PTIO自由基清除相结合，则既能反映RNS清除水平，又能反映ROS清除水平。故，可以较全面地评价其抗氧化活性。 【文献】Xican Li. 2-Phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl 3-oxide (PTIO?) Radical-scavenging: A New and Simple Antioxidant. Journal of Agricultural Food Chemistry. 2017, 65, 6288?6297. 【实验流程图】