ELISA试验方法的相关问题及质量控制.pptxVIP

ELISA试验方法的相关问题及质量控制; 酶联免疫吸附试验 （enzyme linked immunosorbent assay,ELISA) 1971年由瑞典学者Engrall和Perlmann, 荷兰学者Vanweeman和Schuurs报道。 开创了运用酶标记免疫技术进行液体标本中 微量物质测定的实验方法。;酶免疫技术的分类 酶免疫组化 酶免疫技术 均相酶免疫测定 酶免疫测定 液相酶免疫测定 异相酶免疫测定 固相酶免疫测定 （ELISA） ; Ag + Ab* AgAb* + Ab* 均相法：抗原抗体反应后AgAb* 中的标记物失去特性， 不需进行AgAb* 与 Ab*的分离，可直接测 定游离的Ab*量，从而推算标本中的Ag 量。 异相法：抗原抗体反应后，需将AgAb* 与 Ab*，然后 测定AgAb* 或 Ab*的量，从而推算标本中的 Ag 量。 ;ELISA方法的基本原理 （1）使抗原或抗体结合到固相载体表面，并保 持其免疫活性。 （2）使抗原或抗体与酶结合成酶标抗原或抗体， 并保持抗原或抗体的免疫活性和酶的活性。 （3）酶标的抗原或抗体与相应的抗体或抗原反 应后，结合在免疫复合物上的酶催化底物 形成水解、氧化或还原反应，形成有色物 质，其颜色的深浅与标本中的抗原或抗体 的量直接相关。;ELISA方法的基本类型 （一）双抗体夹心法 （二） 间接法 （三） 竞争法;（一）双抗体夹心法 ;（二）间接法 ;（三）竞争法 ;双位点夹心法;捕获法;ELISA试验的方法学原理;;二步法 Ab—Ag+Ab*→Ab—Ag—Ab* Ab*+Ag→Ab*—Ag (洗涤) ;; ELISA方法的影响因素及控制;固相导致抗原的变化 为了测定抗体的水平，需预先将抗原（包被）到极性和疏水性的聚苯乙烯（PS）或聚氯乙烯（PVC）微板上，利用直接物理吸附方法固相???白质抗原，可引起分子够象和抗原性发生改变;固相对抗体的影响 将抗体固相化时，直接吸附法固相抗体分子，除了呈团串状，不均匀分布，易解吸等外，还可发生构象改变，使抗体结合价减少甚至失活。;高剂量钩镰效应(HD-Hook Effects) 发生在固相法试验过程中的，可造成假低值甚至假阴性错误结果的特殊效应，称为HD-Hook效应。 ; 边缘效应(Edge effects) 由于微量反应板周边孔与内部孔升降温速率的差别，造成周边孔与内部孔结果的差异，这就是边缘效应或位置效应; 弥散效应(Diffusion limits) 在固相法中抗原抗体结合，底物与酶的接触，转换的信号产物向液体内弥散的过程中，液相与固相中的分子必须穿过液面的Nernst层，也就是液固屏障，使反应速率受到限制。 ;干扰物质 类风湿因子 补体 嗜异性抗体 血清粘度过大、血脂过高 胆红素、血红蛋白 抗凝剂（肝素、EDTA） 酶类 ;类风湿因子;补体;嗜异性抗体;标本溶血;标本受细菌污染;标本保存不当;标本凝集不全;添加物质的影响;ELISA试验的有关问题;洗涤液的种类： 蒸馏水 吐温-蒸馏水 吐温-生理盐水 PBS-吐温-蒸馏水 Tris-吐温-蒸馏水 （PH均为7.2或7.4） ;Tween 20—月桂酸 （液体） Tween 40—棕榈酸 （液体） Tween 60