标准菌种确认标准操作规程完整.pdf

一 目的 建立标准菌种确认标准操作规程， 以减少菌种污染和生长特性的改变， 保证实验结果的可 靠性和准确性。 二 围 本规程适用于质量控制实验室所用标准储备菌株。 三 容 1.1 试验菌株 大肠埃希菌（ Escherichia coli ）[CMCC(B)44102] 金黄色葡萄球菌（ Staphylococcus aureus ）[CMCC(B)26003] 枯草芽孢杆菌（ Bacillus subtilis ）[CMCC(B)63501] 白色念珠菌（ Candida albicans ）[CMCC(F)64941] 黑曲霉（ Aspergillus niger ）[CMCC(F)98003] 铜绿假单胞菌（ Pseudomonas aeruginosa ）[CMCC(B)10104] 生孢梭菌（ Clostridium sporogenes ）[CMCC(F)98001] 1.1.1 标准菌株 1.1.1.1 标准菌株应来自认可的国或国外菌种收藏机构。 1.1.1.2 标准菌株经过复活并在适宜的培养基中生长后，即为标准储备菌株。 1.1.1.3 标准储备菌株应进行纯度和特性确认。 1.1.2 工作菌株 1.1.2.1 标准储备菌株可用于制备每两个月或定期转种的工作菌株。 1.1.2.2 工作菌株的传代次数应严格控制，不得超过 5 代（从菌种收藏机构获得的标准菌 株为第 0 代），以防止过度的传代增加表型变化的风险。因此必要时，应对工作菌株的纯度和 特性进行确认。 1.2 菌种确认试验的主要容 1.2.1 菌种的纯度确认 1.2.1.1 纯度检测：是指通过适当的方法检测菌种是否为纯培养物。 1.2.1.2 试验容 ①菌落形态：在特定的培养基上，将待检测培养物稀释涂布或平板划线，适宜培养后，同一平 板上的单菌落的大小、 形状、颜色、质地、 光泽等是否相似； 对于两种或以上形态的出发菌株， 应再分别挑取单菌落划线或稀释涂布培养，检测是否重复出现相同特征。 ②镜检特征：对数生长期的培养物革兰氏染色反应应呈现一致性；细胞形状、大小、荚膜、芽 孢等特征应相似。 1.2.2 菌种的特性确认 1.2.2.1 生化试验：各种微生物具有各自的独特的酶系统，因而在代过程中所参与的物质分 解和合成代的产物也不同，这些代产物又具有不同的生化特征。根据此特征，利用生物化学方 法来鉴定不同的微生物的试验即为微生物的生化试验。 1.3 菌种的确定方法 用无菌接种环粘取培养物，在相应的培养基平板上划线分离单个菌落，并在适宜条件下培 养。培养后观察是否具有典型的菌落形态，然后挑取单一纯菌落，进行革兰氏染色、镜检，观 察其染色特性及菌形。再做生化试验或使用菌种鉴定系统进一步鉴定菌种。 1.3.1 大肠埃希菌的确认 1.3.1.1 菌落形态 1.3.1.1.1 取大肠埃希菌新鲜培养物至营养肉汤培养基中，经 35℃培养 18～24h 后，形成菌 膜，管底有粘液状沉淀，培养物有粪臭味。 1.3.1.1.2 取上述培养物接种于曙红亚甲蓝琼脂 (EMB)琼脂平板和麦康凯琼脂平板上， 35℃培 养 18～24h 后，观察结果。 ①曙红亚甲蓝琼脂 (EMB)平板上菌落形态呈紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色 , 菌落中心呈深紫 色或无明显暗色中心，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑、湿润，常有金属光泽。 ②麦康凯琼脂平板上菌落形态呈鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，边缘 整齐，表面光滑，湿润。 1.3.1.2 革兰染色、镜检 1.3.1.2.1 革兰染色 ①以接种环沾取无菌水于洁净载玻片上， 取菌落形态 （①、②）的培养物少许， 制成均匀涂片， 自然或微温，再通过火焰 2～3 次干燥使固定。 ②滴加结晶紫染液，染色 1min，水洗。 ③滴加碘液，媒染 1min，水洗，以滤纸吸干余水。 ④滴加 95﹪乙醇，脱色 20 ～30s，至流出液无色，水洗。 ⑤滴加沙黄染液，复染 1min，待干后，镜检。 1.3.1.2.2 染色结果应是：革兰阳性菌呈蓝紫