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《生物化学实验技术》课程作业 蛋白质含量测定法——考马斯亮蓝法 [实验目的 ] 学习、掌握考马斯亮蓝法（ Bradford 法）测定蛋白质含量的方法 [实验原理 ] 碱性 磷酸 考马斯亮蓝 G 250染料 氨基酸 变为 595nm （蓝色） 芳香族 max [器材与试剂 ] 器材 722 型可见光分光光度计、漩涡混合器、试管 16 支 试剂 1.标准蛋白质溶液，用牛血清清蛋白（ BSA ），配制成 1.00mg/ml 。 2.考马斯亮蓝 G-250 染料试剂：称 100mg 考马斯亮蓝，溶于 50ml 95% 的乙醇后，再加 入 120ml 85% 的磷酸，用水稀释至 1 升。 [实验方法 ] 标准方法 1.取 10 支试管， 分别编号后按 表 1 剂量依次加入标准蛋白 （或未知蛋白）、去离子 水和考马斯亮蓝染料。每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。 2.加完染料 20min 后，使用 722 分光光度计，塑料比色皿，在 595nm 处测量吸光度 A 595 。 3.用标准蛋白浓度（ mg/ml ）为横坐标，用 A 595 为纵坐标，进行直线拟合，得到标准 曲线。根据测得的未知样品的 A 595 ，代入公式即可求得未知样品的蛋白质含量。根 据所测样品的吸光度 ,在标准曲线上查得相应的蛋白质含量 ,按下式计算 : 查得的蛋白质（ g / g ） 提取液总体积（ ml ） 样品蛋白质含量 ( μg/g 鲜重 ) = 样品重（ g） 测定时提取液体积（ ml ） SDS 干扰实验 1.取 5 支试管， 分别编号后按表 2 剂量依次加入标准蛋白、 SDS、去离子水和考马斯 亮蓝染料。每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。 2.加完染料 20min 后，使用 753 分光光度计，塑料比色皿，在 595nm 处测量吸光度 A 595 。 [实验数据与结果分析 ] （一）标准方法的数据和图 表 1 考马斯亮蓝标准法实验表格 第 1页 《生物化学实验技术》课程作业 管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 标准蛋白质 0 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 （1.00mg/ml ） 未知蛋白质 0.04 0.08 0.10 （约0.5mg/ml ） 蒸馏水 0.1 0.09 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0.06 0.02 0 考马斯亮蓝 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 G-250 试剂 对应的吸光度 A