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罗氏地高辛说明书 罗氏地高辛说明书 DIG DNA Labeling and Detection Kit 采用地高辛-dUTP 进行随机引物DNA 标记，碱性标记，利用NBT/BCIP 酶联免疫，随时即用。 此试剂盒可对10ng-3μgDNA进行25次标记反应， 可检测10×10cm 2面积的杂交膜50张 指导手册 1 前言 1.1 内容表 1 前言 1.1 内容表 1.2 试剂盒成分 2. 介绍 2.1 产品简介 3. 操作步骤和所需材料 3.1 在你开始前 3.2 流程图 3.3 地高辛标记DNA 3.4 标记效率的确定 3.5 DNA的转移和固定 3.6 杂交 3.7 免疫检测 3.8 DNA印记的洗脱和再杂交 除了上表中列出的试剂外，你必须准备一些溶液。在下表中，你可以找到不同操作程序需要准备的设备概要。 2.1 产品概况 实验原则 此试剂盒采用DIG(地高辛) ，一种甾类半抗原，steroid hapten 去标记DNA 地高辛标记DNA 探针可以用于：所有类型的滤膜杂交 样品材料 至少100bp 的DNA 片段 线性的质粒，cos 质粒或者DNA 超螺旋的DNA 一个试剂盒足够用于: 25个标准的标记反应，每个反应的膜板DNA 不超过3μg； 并可以检测50张10×10cm 2的杂交膜。 根据操作步骤中的说明对未标记的对照DNA 【pBR328】进行标记，并按照下面的标准检测操作方法在点杂交中用0.1pg 同源DNA 点在膜上16h 后成色显影检测。 试剂盒的储存和稳定性 未开封的试剂盒在保质期内可以稳定的存放在-15℃到-25℃（保质期印在标 签上）。在干冰中运输。 一旦开封，请根据下表选择适宜的储存条件。 采用southern 杂交从1μg人胎盘 DNA （经Bgl Ⅱ或EcoR Ⅰ酶切）中检测到单拷贝基因。 3． 实验步骤和所需材料 3.1 在你开始前 主要的操作要求 此表中描述了地高辛标记和检测中主要的提示： 3.3 地高辛标记DNA 介绍 随机引物标记的DNA 带有地高辛-11-dUTP, 这一标记采用的是地高辛高效引物试剂，这是一种含有随机六碳糖，dNTP 混合物的5×浓度标记混合物，其中dNTP 混合物包括碱性标记的地高辛-11-dUTP ，标记级的Klenow 酶和适合的反应缓冲液。 附加设备和所需试剂 水浴 冰水混合物 此表中列出了成分，储存条件和除了试剂盒成分外所需试剂的用途。 模板DNA ：模板DNA 所需特征： 如果你想要完成基因组的southern 杂交，你应该利用琼脂糖凝胶电泳将插入载体的模板DNA 从载体上分离出来。 为了从凝胶中分离DNA, 你可以用琼脂糖凝胶DNA 提取试剂盒(the Agarose Gel DNA Extraction Kit)进行大小在400bp-5kbp 范围内DNA 片段的回收。 这一试剂盒既可以用于标准琼脂糖凝胶也可用于低熔点琼脂糖凝胶。然后，不需要进一步纯化即可对DNA 片段进行高效的地高辛标记。然后标记好的探针应该用高效的PCR 产物纯化试剂盒（High Pure PCR Product Purification Kit）进行纯化，以去除残留的琼脂糖颗粒。 步骤 此步骤用于标记10ng-3μg DNA 。可以通过扩大所有成分和体积标记更大量的DNA （最高达10μg）。 标记反应的产量 表1： 此表向您展示了在适宜条件下地高辛高效引物标记的产量。在标准反应中每个实验采用1μg DNA 作为模板。1小时内，大约有15%的核苷酸参与到了0.8μg新合成的地高辛标记DNA 中。20小时后消耗了大约38%的核苷酸。 1小时和反应20小时的差异。地高辛标记DNA 的产量由放射线示踪器进行测定，并通过斑点杂交进行证实 （10个独立标记实验的平均值）。 3.4 标记效率的确定 介绍 地高辛标记DNA 产量的确定对于获得最佳的，具有可重现性的杂交结果十分重要。在杂交混合物中探针浓度过高容易产生背景，而太低浓度则容易导致信号弱。 实验原则 检测标记探针质量的好方法是直接检测法。 所需附加溶液的制备 请找出下表中的成分和所需制备的试剂。下表中的缓冲液也可以在地高辛洗涤和封阻缓冲液无DNA 酶和RNA 酶系列产品中获得。 试剂盒工作溶液的制备 下表中列出试剂盒工作溶液的制备方法： 根据合成核苷酸的预期产量开始下面的的系列稀释，标记的探针和地高辛