实时荧光定量PCR.pdfVIP

实时荧光定量 PCR 定义： 实时荧光定量 PCR （Quantitative Real-time PCR ）是一种在 DNA 扩增反应中，以荧光 化学物质检测每次聚合酶链式反应（ PCR）循环后所得到的 PCR 产物总量的方法。通过内 参或者外参法对待测样品中的特定 DNA 序列进行定量分析的方法。由于在 PCR 扩增的过 程中，由于模板的 Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为最终产物定量的依 据。 荧光定量 PCR 原理 在 PCR 扩增时，加入一对引物的同时再加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核 苷酸， 两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。 探针完整时， 报告基团发射的 荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时 , 探针结合在 DNA 任意一条单链上 ;PCR 扩增时， Taq 酶的 5’端－ 3’端外切酶活性将探针酶切降解， 使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离， 从而荧 光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧 光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步。 荧光定量 PCR 原理示意图 实验步骤： 一、组织或者细胞中 RNA 抽提 1、匀浆处理 : a. 组织 将组织在液氮中磨碎， 每 50-100 mg 组织加入 1 ml Trizol ，用匀浆仪进行匀浆 - 1 - 处理。样品体积不应超过 Trizol 体积 10℅。 2 b. 单层培养细胞 直接在培养板中加入 Trizol 裂解细胞，每 10 cm 面积加 1 ml ，用 移液器吸打几次。 Trizol 的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。 Trizol 加量不足 可能导致提取的 RNA 有 DNA 污染。 6 7 动物、植物、酵母细胞或 1×10 细菌细胞加 c. 细胞悬液 离心收集细胞，每 5-10 × 10 入 1 ml Trizol ，反复吸打。 加 Trizol 之前不要洗涤细胞以免 mRNA 降解。一些酵母和细菌细 胞需用匀浆仪处理。 (注意：匀浆一定要彻底 ，是提取高质量 RNA 的前提； 细胞数量与 Trizol 的比例，细胞的数量不能过多。 ) 2 、将匀浆样品在室温（ 15-30℃）放置 5 min ，使核酸蛋白复合物完全分离。 3 、每使用 1 ml Trizol 加入 0.2 ml 氯仿，立即 剧烈振荡 ，室温放置 3 min 。此步骤震荡一 定要充分，否则会影响到 RNA 的提取效率； 4 、2-8 ℃ 10000 ×g离心 15 min 。 样品分为三层：底层为黄色（红或绿）有机相，上层为无色水相和一个中间层。 RNA 主要在水相中，水相体积约为所用 Trizol 试剂的 60℅。 5 、把水相转移到新管中（如要分离 DNA 和蛋白质可保留有机相） ，用异丙醇沉淀水相中 的 RNA 。每使用 1 ml Tr