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米氏常数的测定 米氏常数的测定 底物浓度对酶促反应速度的影响 ——米氏常数的测定 1.1了解底物浓度对酶促反应的影响。 1.2掌握测定米氏常数K m 的原理和方法。 酶促反应速度与底物浓度的关系可用米氏方程来表示： v ——反应初速度（微摩尔浓度变化/min）； V ——最大反应速度（微摩尔浓度变化/min）； [s]——底物浓度（mol/L）； K m ——米氏常数（mol/L）。 这个方程表明当已知K m 及V 时，酶促反应速度与底物浓度之间的定量关系。K m 值等于酶促反应速度达到最大反应速度一半时所对应的底物浓度，是酶的特征常数之一。不同的酶，K m 值不同，同一种酶与不同底物反应K m 值也不同，K m 值可以近似地反应酶与底物的亲和力大小：K m 值越大，表明亲和力小；K m 值小，表明亲和力大。则测K m 值是酶学研究的一个重要方法。大多数纯酶的K m 值在0.01～100mmol/L。 Linewaeaver-Burk 作图法（双倒数作图法）是用实验方法测K m 值的最常用的简便方法： 1K m 11 v V [s ]V 实验时可选择不同的[s]，测定对应的v ，以 v [s ]m V 的直线，其截距 11则为，由此可求出K m 的值（截距的负倒数）。 [s ]K m K m +[s ] 本实验以胰蛋白酶消化酪蛋白为例，采用Linewaeaver-Burk 双倒数作图法测定双倒数作图法。胰蛋白酶催化蛋白质中碱性氨基酸（L-精氨酸和L-赖氨酸）的羧基所形成的肽键水解。水解时有自由氨基生成，可用甲醛滴定法判断自由氨基增加的数量而跟踪反应，求得初速度。 三．试剂和器材 A.10～30g/L的酪蛋白溶液（pH8.5）： 分别取10、20、25、30g 酪蛋白溶于约900mL 水中，加20mL 1mol/L NaOH连续振荡，微热直至溶解，以1mol/L HCl 或1mol/L NaOH 调pH 至8.5，定容1L ，即生成四种不同[s]的酪蛋白标准溶液。 B. 中性甲醛溶液： 100mL 分析甲醛加20 mL 0.25％酚酞乙醇溶液，以0.1mol/L NaOH滴至微红，密闭于玻璃瓶中。 C.0.25%酚酞乙醇溶液： 2.5g 酚酞以50%乙醇溶解，并定容至1L 。 D. 标准0.1mol/L NaOH溶液： 事先用邻苯二甲酸氢钾标定过。 胰酶溶液：称取3g 胰酶（胰蛋白酶、胰淀粉酶、胰脂肪酶的混合物）溶于25ml 蒸馏水中，放入冰箱保存。 3.3 器材 恒温水浴；50ml 三角烧瓶（×16），150ml 三角烧瓶（×4）；吸管5ml （×1），10ml （×5）；量筒100ml （×4）；25ml 碱式滴定管及滴定台，蝴蝶夹；恒温水浴；滴管。 1. 取50mL 三角瓶4个，加入5mL 甲醛与1滴酚酞，以0.1mol/L标准NaOH 滴 定至微红色，4个瓶颜色应当一致，编号。 2. 量取30g/L酪蛋白50mL ，加入一150mL 三角瓶，37℃保温10min ，然后吸取 5mL 酶液加到酪蛋白液中。（同时计时！）充分混合后立即取出10mL 反应液（定为0号样品）加入一含甲醛的小三角瓶中（1号）加10滴酚酞。以0.1mol/L NaOH 毫升数，记下耗去的0.1mol/L标准NaOH 的毫升数。 3. 在2min ，4min ，6min 时，分别取出10mL 反应液，加入2号，3号，4号小三角瓶，同上操作，记下耗去NaOH 的毫升数。 以滴定度（即NaOH 的毫升数）对时间作图，得一直线，其斜率即初速度为V 40（相对于40g/L的酪蛋白浓度）。 然后分别量取25g/L，20g/L，10g/L的酪蛋白溶液，重复上述操作，分别测出V 25 、V 20 、V 10。 利用上述结果，以1/v对1/[s]作图，即求出V 与Km 值。 五．实验数据处理 5.1. 实验原始数据记录：如表1中所示。 表1 实验数据记录 实验号（酶解时间/min） 酪蛋白浓度 10g/L 20g/L 25g/L 30g/L NaOH 消耗的体积/ml 0.88 1.19 1.51 1.51 1.32 1.67 1.87 1.98 1.74 2.35 2.80 2.99 2.07 2.29 2.53 5.2相对各浓度酪蛋白的各初速度值 以滴定度（即NaOH 的毫升数）对时间作图，得一直线，其斜率即初速度值。 （1）相对于10g/L