(生物化学)第14章基因工程-最新课件.pptVIP

(生物化学)第14章基因工程;一、同源重组 (homologous recombination)  发生在同源序列间的重组称为同源重组， 又称根本重组。是最根本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。;;二、细菌的基因转移与重组;;质粒 —— 细菌染色体外的小型环状双链DNA分子;可接合质粒如 F 因子(F factor) ;〔二〕转化作用;例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。;〔三〕转导作用;λ噬菌体的生活史;;;四、转座重组;由转座子介导的转座; 基因工程(genetic engineering);基因工程的 原理;又称为基因克隆或分子克隆技术，;第 二 节 重组DNA技术;一、重组DNA技术相关概念 ;(1)分子克隆(molecular clone),即DNA 克隆 ; (2)细胞克隆； (3)个体克隆〔动物或植物〕。　;DNA克隆 应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质〔同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA〕与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA (recombinant DNA) 。 ;1. 目的基因的获取 2. 克隆载体的选择与构建 3. 外源基因与载体的连接 4. 重组DNA导入受体菌 5. 重组体的筛选 6. 克隆基因的表达;分：别离目的基因 切：对目的基因和载体适当切割 接：目的基因与载体连接 转：重组DNA转入受体菌 筛：筛选出含有重组体的受菌体;1、目的基因;1. 化学合成法 要求：目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。 2.基因组DNA文库(genomic DNA library) 3. cDNA文库(cDNA library) 4. 聚合酶链反响(polymerase chain reaction, PCR) ;* 化学合成法获取目的基因;2、克隆载体的选择与构建;〔1〕能够自我复制，并带动插入的外源基因 一起复制 〔2〕具有适宜的限制性酶切位点〔多克隆位点，外源DNA插入点〕 〔3〕具有适宜的筛选标记 〔4〕细胞内拷贝数要多 〔5〕载体的分子量要小，以容纳较大的外源DNA。 〔6〕细胞内稳定性高; ;质粒载体的一般结构;λ噬菌体DNA改造系统 λgt系列〔插入型，适用cDNA克隆〕 EMBL系列??置换型，适用基因组克隆〕;3. 粘性质粒(cosmid);酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒DNA改造的载体 〔如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒〕;克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。 用于目的基因的克隆、扩增、序列分析和体外定点突变 表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。 在宿主细胞中表达外源目的基因，获得大量表达产物 ;〔三〕、 载体和目的基因的的切割;重组DNA技术中常用的工具酶;限制性核酸内切酶-----“分子手术刀〞;第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。;第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。;分类 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 〔基因工程技术中常用Ⅱ型〕;Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome) ;Bam HⅠ; 被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。;Enzymes involved in DNA cloningRestriction endonucleases (II);同功异源酶 来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。;同尾酶 有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatible end)。;〔四〕外源基因与载体的连接;DNA连接酶;根据酶的来源不同，可以将这些酶分为两类： 1. ：大肠杆菌，只能连接互补的粘性末端。 2. T4连接酶：T4