提纯菠萝蛋白酶的分子量的鉴定.pptVIP

用SDS测定蛋白质Mr应注意问题： 1．如果蛋白质-SDS复合物不能达到1.4 SDS／lg蛋白质的比率并具有相同的构象，就不能得到准确的结果。 影响蛋白质和SDS结合的因素主要有以下3个： (1)二硫键是否完全被还原：只有在蛋白质分子内的二硫键被彻底还原的情况下，SDS才能定量地结合到蛋白质分子上去，并使之具有相同的构象。 —般以巯基乙醇作还原剂。在有些情况下，还需进一步将形成的巯基烷基化，以免在电泳过程中重新氧化而形成蛋白质聚合体 (2)溶液中SDS的浓度：溶液中SDS的总量，至少要比蛋白质的量高3倍，一般需高达10倍以上。 (3)溶液的离子强度：溶液的离子强度应较低，最高不能超过0.26， 因为SDS在水溶液中是以单体和分子团的混合体而存在. SDS结合到蛋内质分子上的量，仅决定于平衡时SDS单体的浓度而不是总浓度. 在低离子强度的溶液中，SDS单体具有较高的平衡浓度。 2．不同凝胶浓度适用于不同的Mr范围. Weber的实验指出，在5%的凝胶中，Mr为25 000～200 000的蛋白质，其Mr的对数与迁移率呈直线关系； 在10％的凝胶中，Mr为10 000～70 000蛋白质，其Mr的对数与迁移率呈直线关系； 在15％的凝胶中，Mr为10 000～50 000蛋白质，其Mr的对数与迁移率呈直线关系； 3.33％(以上各种浓度的凝胶，其交联度都是2.6%)的凝胶可用