6第6章DNA重组技术.pptx

第六章 DNA重组技术;第六章 DNA重组技术; DNA克隆（DNA clone） 在体外对DNA分子进行重组，构建成具有自主复制能力的重组DNA分子，再导入宿主细胞进行大量扩增，最终获得大量同一的DNA分子 亦称分子克隆或DNA重组技术;第六章 DNA重组技术;第一节 常用的工具酶;第一节 常用的工具酶; 主要的工具酶:;第一节 常用的工具酶;一、限制性内切酶;一、限制性内切酶; （一）分类;一、限制性内切酶;（二）命名;一、限制性内切酶;(三)Ⅱ类限制性核酸内切酶识别序列特点;Bam HⅠ;GGATCC CCTAGG;Bam HⅠ;（四）限制性内切酶的应用 ;一、限制性内切酶; 1.酶活力单位 在合适温度、pH值和离子强度等条件下，1小 时内完全消化1μg特异DNA底物所需的酶量，定义 为一个活力单位。; 2.星号活性 限制性内切酶在非标准反应条件下，对识别序列的特异性下降，能切割一些与特异识别顺序类似的序列，一般在酶的右上角加 “*” 表示 克隆过程中需同时进行双酶切时，应选用二种酶都能接受的反应缓冲体系，否则可能影响酶的特异性 ; 3.注意事项 底物DNA不能含有痕量的酚、氯仿和乙醚 溶液中不能含SDS和过量的盐， EDTA的含量不能大于10mmol/L;反应缓冲体系中一般可加入2-巯基乙醇或二硫苏糖醇，防止含巯基酶的氧化失活 加入牛血清白蛋白稳定酶活性 操作时应注意混匀反应体系;一、限制性内切酶;(六) 甲基化酶;一、限制性内切酶;3.甲基化酶的应用;二、DNA连接酶;二、DNA连接酶;DNA连接酶的特点： T4噬菌体DNA连接酶能连接带粘性末端或平末端的DNA分子 大肠杆菌DNA连接酶不能连接平末端 DNA分子 DNA重组技术常用T4噬菌体DNA连接酶;T4噬菌体DNA连接酶连接带粘性末端DNA分子的效率远高于连接平末端的DNA分子 连接反应需要ATP、Mg2+ 和二硫苏糖醇，最适pH为7.2～7.4，ATP为连接反应提供能量，二硫苏糖醇可提高连接效率 ;三、分子克隆中常用的其他酶;三、分子克隆中常用的其他酶;三、分子克隆中常用的其他酶; 6.DNA聚合酶Ⅰ 合成双链DNA分子 缺口平移法，获得高比活性探针 DNA序列分析 补平3′端 ;7.Klenow片段（DNA聚合酶Ⅰ大片段） 具有完整的DNA聚合酶活性 保留3???→5′外切酶活性 无5′→3′外切酶活性;Klenow片段的主要应用： 合成cDNA第二链 补齐双链DNA分子3′端或标记3′端 DNA序列分析 ;第二节 常用载体; ;第二节 常用载体;载体构建和选择的条件：;第二节 常用载体;第二节 常用载体; 一、质粒载体;理想质粒载体的特点： ;一、质粒载体; 一、质粒载体;（一） pBR322质粒载体;pBR322质粒载体的特点：; 4.较小的分子量 易于自身DNA的纯化，而且能有效地克隆6kb 大小的外源DNA片段。 5.较高的拷贝数 每个细胞达1000～3000个拷贝。 ; 一、质粒载体;（二） pUC质粒载体系列 ;典型的pUC质粒载体有4个组成部分： 来自pBR322 质粒的复制起始点 Ampr基因 大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因（LacZ）启动子及编码α-肽链的DNA序列（LacZ′基因） 多克隆位点（位于LacZ′基因中靠近5′端）;pUC系列的优越性; 一、质粒载体;二、噬菌体载体;二、噬菌体载体;二、噬菌体载体;二、噬菌体载体;二、噬菌体载体;三、穿梭载体;三、穿梭载体;三、穿梭载体;（一）SV40（猿猴病毒）载体 ;例：PSVK3质粒 ;PSVK3具有下列构件： 1.原核系统构件： 复制子和丝状噬菌体复制起始位点fl 筛选标志（Ampr） 启动子（T7启动子） 2.真核系统构件： SV40复制起始点 SV40早期启动子;3.RNA修饰信号： SV40小T抗原拼接信号 SV40早期区mRNA polyA加尾信号 4.多克隆位点： SV40启动子下游有8个酶切位点 ;三、穿梭载体;（二）逆转录病毒载体 ;病毒基因组自身含有完整高效的调控元件 病毒可通过主动感染方式进入宿主细胞，并能有效地整合到宿主染色体基因组中，与染色体一起复制、长期存在 逆转录病毒作为载体需要相应的外包装，以形成完整的体系;逆转录病毒载体的局限性： 逆转录病毒载体进入细胞依赖于细胞表面的受体，并且只能感染并整合到分裂增殖期的细胞 装载容量较小，仅8kb左右 可能存在具有复制能力的野生型病毒; 常用外源DNA片段取代病毒中的癌基因，即卸去其致癌性，称为卸甲载体（disarmed vector）。 ;四、人工染色体;YAC主要调控元