原代细胞培养和细胞实验设计陈加祥.pptxVIP

第一节、原代细胞培养;;原代细胞的培养是从供体取得组织细胞在体外进行的首次培养，是建立细胞系的第一步。 原代细胞生物学特性未发生很大变化，最接近和反映体内生长特性。;;一、原代细胞的取材 ;;二、原代细胞的分离和制作 ;;2、实体组织材料的分离方法 实体组织细胞间结合紧密，为了使组织中的细胞充分分散，形成细胞悬液，可采用： （1）机械分散法 （2）消化分离法 ;（1）机械分散法;;（2）消化分离法;1）酶消化分离法;;② 酶的活力：新鲜配制，低温保存。 ③ 酶的浓度: 为0.1%-0.25%?? ④ 温度: 常用的温度为37 ℃。 ⑤ pH: 选用7.6~8.0之间。 ;;（b）胶原酶（Collagenase）;;胶原酶Ⅰ：用于上皮、肺，脂肪和肾上腺组织细胞的分离。 胶原酶Ⅱ：适用于肝脏，骨，甲状腺，心脏和唾液腺组织。 胶原酶Ⅳ：包含至少7种蛋白酶成分，能消化多种组织。 胶原酶Ⅴ：可用于胰腺小岛组织的分离;（2）非酶消化法（EDTA消化法）;;消化分离法的操作步骤：;;注意事项;三、原代细胞的培养方法 ;1. 淋巴细胞分离原理（密度梯度离心）;2. 淋巴细胞分离步骤：;;注意事项;2、组织块培养法（组织培养）;举例：贴块法培养血管平滑肌细胞;;7-9天开始有细胞从组织块周围爬出;3. 消化法原代培养HUVEC;;;四、培养细胞的纯化;1、自然纯化;2、人工纯化;（2）机械划除